Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Реакция аминоацилирования тРНК 9
1.2. Два класса аминоацил-тРНК-синтетаз. 9
1.3. Структура тРНК 13
1.4. Общие закономерности и особенности высокоспецифичного взаимодействия аминоацил-тРНК-синтетаз с тРНК: методы выявления элементов идентичности в тРНК и исследования их функциональной роли 15
1.4.1. In vivo и in vitro методы определения элементов специфичности 15
1.4.2. Распределение элементов узнавания в тРНК 17
1.4.3. Относительный вклад элементов узнавания в кинетические параметры аминоацилирования 23
1.4.4. Аминоацшшрование мини-тРНК субстратов (mini- и microhelices) 25
1.4.5. Функциональная роль элементов узнавания в обеспечении специфичности на различных этапах взаимодействия 26
1.4.6. Природа контактов, обеспечивающих специфичность взаимодействия 32
1.4.7. Динамика взаимодействия с тРНК 34
1.4.8. Механизмы контроля продуктивного связывания З-конца тРНК ..36
1.5. Фенилаланил-тРНК-синтетаза: структурно-функциональные особенности
фермента и его взаимодействия с субстратами 39
1.5.1. Общая характеристика структуры фермента... 40
1.5.2. Взаимодействие фенилаланил-тРНК-синтетазы с тРНКр е 41
1.5.3. Структурные основы каталитической функции фермента 45
Глава 2. Экспериментальная часть 50
2.1. Материалы 50
2.2. Методы исследования 51
2.2.1. Выделение плазмидных ДНК ...51
2.2.2. Гидролиз плазмидных ДНК эндонуклеазой рестрикции 53
2.2.3. Синтез и выделение тРНК-транскриптов 53
2.2.4.32Р-Мечение тРНК по 5-концу. 53
2.2.5. Ступенчатая деградация тРНК с З-конца. 54
2.2.6. УФ-индуцируемая модификация мутантных TPHKPhe 55
2.2.7. Частичный нуклеазный и щелочной гидролиз тРНК... 55
2.2.8. Получение транскриптов тРНКРНе, содержащих остаток s4U(s6G) на З-конце, с использованием концевой СТР(АТР):тРНК-нуклеотидилтрансферазы 55
2.2.9. Получение диальдегидных производных тРНКРЬе 56
2.2.10. Получение s U-замещенных аналогов тРНКр е с использованием Т4 РНК-лигазы 56
2.2.11. Аминоацилирование тРНК е, тРНК е-транскрипта и его фотоактивных аналогов и неспецифичных тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой 57
2.2.12. Мечение фенилаланил-тРНК-синтетазы фотореакциошюспособными аналогами тРНКРЬг и разделение продуктов модификации. 57
2.2.13. Аффинное мечение фенилаланил-тРНК-синтетазы диальдегидными производными тРНК е 58
2.2.14. Нуклеазный гидролиз продуктов модификации фенилаланил-тРНК-синтетазы 58
2.2.15. Определение констант диссоциации комплексов фенилаланил-тРНК-синтетазы с тРНК 59
2.2.16. Гель-электофорез нуклеиновых кислот и белков 60
Глава 3. Функциональная роль структурных элементов тРНК на различных стадиях взаимодействия с фенилаланил-тРНК- синтетазой 62
3.1. Эффективность распознавания тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой Г. thermophilus на стадии связывания 62
3.1.1. тРНКРЬе Е. coli-эффективный субстрат фенилаланил-тРНК-синтетазы Т. thermophilus в связывании 62
3.1.2. Исследование стабильности третичной структуры мутантных TPHKphe с нуклеотидными заменами в 19-ом и 56-ом положениях 65
3.1.3. Сравнение параметров связывания и аминоацилирования мутантных тРНК№е. 69
3.1.4. Взаимодействие фенилаланил-тРНК-синтетазы с неспецифичными тРНК 76
3.1.5. Заключение к разделу 3.1 77
3.2. Роль низкомолекулярных субстратов и элементов узнавания в продуктивном взаимодействии фенилаланил-тРНК-синтетазы Т. thermophilus с акцепторным концом тРНКРЬе 79
3.2.1. Получение реакционноспособных аналогов тРНК е, исследование их субстратных свойств и аффинная модификация фенилаланил-тРНК-синтетазы 79
3.2.2. Взаимодействие фенилаланил-тРНК-синтетазы с акцепторным концом тРНКР1ге в присутствии низкомолекулярных субстратов 90
3.2.2.1. Влияние Phe и АТР на модификацию фенилаланил-тРНК-синтетазы различными аналогами тРНКрЧ 90
3.2.2.2. Роль низкомолекулярных субстратов в продуктивном связывании акцепторного конца тРНК№е 92
3.3. Влияние нуклеотидных замен в тРНК е на ориентацию акцепторного конца в комплексе с фснилаланил-тРНК-синтетазой 103
3.3.1. Сравнительное исследование з4и-индуцируемой модификации фенилалаиил-тРНК-синтетазы аналогами тРНК№е, содержащими замены элементов узнавания , 103
3.3.2. Роль элементов узнавания тРНК е в функциональной ориентации акцепторного конца 111
Выводы 116
Список литературы 118
Приложение 138
