Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 15
1.1. Фармакологические свойства ладастена и механизмы их реализации 15
1.2. Рецепторы и внутриклеточные сигнальные системы, участвующие в реализации механизмов действия психофармакологических средств 41
1.3. Механизмы формирования реакций клеток в ответ на действие психофармакологических средств 64
Собственные исследования
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследований 78
2.1. Материалы исследований 78
2.1.1. Препарат 78
2.1.2. Экспериментальные животные 78
2.1.3. Извлечение структур головного мозга крыс 78
2.1.4. Бактериальные штаммы и векторы 79
2.1.5. Перечень использованных реактивов и материалов 79
2.2. Методы исследований 84
2.2.1. Методы исследования активности протеинкиназ и Са2+-АТФазы 84
2.2.1.1. Выделение белков цитоплазмы 84
2.2.1.2. Выделение белков мембраны 85
2.2.1.3. Фосфорилирование белков in vivo 85
2.2.1.4. Электрофорез белков 86
2.2.1.5. Определение активности протеинкиназ 86
2.2.1.6. Электроперенос белков из акриламидных гелей на мембранные фильтры (блоттинг) 87
2.2.1.7. Гибридизация с антителами 87
2.2.1.8. Детекция 88
2.2.1.9. Определение активности Са2+-АТФазы 88
2.2.2. Методы исследования дифференциальной экспрессии генов 89
2.2.2.1. Выделение суммарной РНК 89
2.2.2.2. Синтез кДНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы 90
2.2.2.3. Количественная ОТ-ПЦР в режиме реального времени 90
2.2.2.4. Гибридизация на макрочипах 96
2.2.2.5. Анализ изображений радиоавтографов 97
2.2.3. Методы исследования метилирования остатков цитозина в ДНК 98
2.2.3.1. Выделение суммарной ДНК 98
2.2.3.2. Модификация нуклеотидов бисульфитом натрия 99
2.2.3.3. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 99
2.2.3.4. Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях 100
2.2.3.5. Элюция ДНК из агарозных гелей 101
2.2.3.6. Лигирование продуктов ПЦР 102
2.2.3.7. Подготовка компетентных клеток 102
2.2.3.8. Трансформация компетентных клеток Rcoli рекомбинантной ДНК 103
2.2.3.9. Выделение и очистка плазмидной ДНК 103
2.2.3.10. Секвенирование ДНК 105
2.2.3.11. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 105
2.2.4. Методы протеомного анализа белков 105
2.2.4.1. Двумерный электрофорез белков 105
2.2.4.2. Анализ изображений двумерных электрофореграмм 106
2.2.4.3. Гидролиз белков и MALDI-TOF масс-спектрометрия 106
2.2.5. Методы исследования функционального состояния отдельных компонентов иммунной системы 107
2.2.5.1. Выделение лимфоцитов крови 107
2.2.5.2. Приготовление тотального клеточного лизата для иммуноблоттинга 108
2.2.5.3. Определение пролифсративной активности лимфоцитов 108
2.2.5.4. Определение активности апоптоза лимфоцитов, суммарной активности каспаз и белков-регуляторов апоптоза 108
2.2.6. Методы анализа ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов 110
2.2.6.1. Приготовление ядерного экстракта 110
2.2.6.2. Идентификация транскрипционных факторов 110
2.2.6.3. Детекция результатов гибридизации на TranSignal Protein/DNA Arrays 111
2.2.6.4. Анализ результатов гибридизации на TranSignal Protein/DNA Arrays 112
2.2.7. Определение количественного содержания L-ДОФА и дофамина 112
2.2.8. Электрофизиологические исследования 113
ГЛАВА 3 Активность протеинкиназ в клетках головного мозга крыс при однократном введении ладастена 115
3.1. Фосфорилирование белков in vivo 115
3.2. Влияние ладастена на активность Са27фосфолипид-зависимых протеинкиназ (протеинкиназа С) в клетках головного мозга крыс 116
3.3. Влияние ладастена на активность Са27кальмодулин-зависимых протеинкиназ II (СаМК II) в клетках стриатума, гипоталамуса и гиппокампа головного мозга крыс 122
3.4. Влияние ладастена на активность цАМФ-зависимых протеинкиназ (протеинкиназа А) в клетках головного мозга крыс 126
3.5. Влияние ладастена на активность митоген-активируемых киназ (ERK1/2) в клетках стриатума, гипоталамуса и гиппокампа головного мозга крыс 130
3.6. Влияние ладастена на экспрессию генов нейротрофинов
NGF и BDNF 136
ГЛАВА 4 Влияние ладастена на днк-связывающую активность транскрипционных факторов 140
ГЛАВА 5 Дифференциальная экспрессия генов и белков в клетках головного мозга крыс под действием ладастена 152
5.1. Анализ экспрессии генов на макрочипе, содержащем 588 фрагментов генов крысы 152
5.2. Анализ экспрессии генов на макрочипе, содержащем 1176 фрагментов генов крысы 155
5.3. Количественный анализ экспрессии предполагаемых генов-мишеней, выявленных гибридизацией на кДНК макрочипах, методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени 158
5.3.1. Гены ферментов различных метаболических путей 165
5.3.2. Гены регуляторных нейропептидов и их рецепторов 167
5.3.3. Гены белков синаптических функций 172
5.3.4. Гены белков цитоскелета и межклеточных взаимодействий 180
5.3.5. Гены, кодирующие компоненты сигнальных путей 183
5.3.6. Гены опухолевых супрессоров 185
5.4. Влияние ладастена на спектр экспрессирующихся белков в клетках головного мозга крыс 187
5.4.1. Белки-ферменты гликолитического метаболизма 190
5.4.2. Стрессовые белки и белки-шапероны 191
5.4.3. Защитные белки 193
5.4.4. Синаптические белки 194
ГЛАВА 6 Экспрессия гена тирозингидроксилазы вразных структурах головного мозга крыс при действии ладастена и эпигенетическиемеханизмы её регуляции 197
6.1. Влияние ладастена на экспрессию гена, белка и активность тирозингидроксилазы и содержание L-ДОФА и дофамина в различных структурах головного мозга крыс 197
6.1.1. Вентральная область покрышки и прилежащее ядро 197
6.1.2. Гипоталамус 200
6.1.3. Стриатум 203
6.1.4. Гиппокамп 206
6.2. Влияние ладастена на характер метилирования цитозина в промоторной области гена тирозингидроксилазы в клетках гипоталамуса головного мозга крыс 219
ГЛАВА 7 Влияние ладастена на пролиферативную активность и апоптотическую реактивность т-лимфоцитов 235
7.1. Влияние ладастена на активационно-индуцированную экспрессию FAS-рецептора на Т-лимфоцитах и их чувствительность к FAS-индуцированному апоптозу 239
ГЛАВА 8 Влияние ладастена на синаптическую пластичность в гиппокампе 247
Заключение 254
Выводы 272
Список литературы
