Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .14
1.1. Патогенетическое обоснование основных мишеней и принципов гиполипидемического действия лекарственных средств 15
1.1.1. Метаболизм холестерола в физиологических условиях 15
1.1.2. Молекулярно-генетические механизмы поглощения и синтеза холестерола de novo 19
1.1.3. Молекулярно-генетическая регуляция синтеза жирных кислот и триацилглицеролов 25
1.1.4. Молекулярно-генетическая регуляция катаболизма жирных кислот
1.2. Экспериментальные модели гиперлипидемии .29
1.3. Терапия гиперлипидемии: современные подходы
1.3.1. Современные гиполипидемические средства .37
1.3.2. Сесквитерпеновые лактоны – перспективные соединения для профилактики и лечения гиперлипидемии 40
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования .45
2.1. Характеристика объекта исследования .45
2.2. Материал исследования
2.2.1. Культивирование клеточной культуры линии НТС .46
2.2.2. Исследования на крысах линии Wistar 47
2.3. Методы исследования 51
2.3.1. Определение жизнеспособности клеточной культуры линии НТС .52
2.3.2. Определение содержания липидов в клеточной культуре линии НТС, в сыворотке крови и печени крыс
2.3.2.1. Определение содержания липидов в клетках гепатомы флуоресцентным методом с красителем Nile Red 53
2.3.2.2. Окрашивание нейтральных липидов красителем Oil Red O 54
2.3.2.3. Определение содержания триацилглицеролов в клеточной культуре НТС,
в сыворотке крови и печени крыс ферментативным методом 55
2.3.2.4. Определение содержания холестерола в клеточной культуре НТС, в сыворотке крови и печени крыс ферментативным методом .56
2.3.2.5. Определение содержания свободных жирных кислот в сыворотке крови крыс ферментативным методом 56
2.3.2.6.Определение содержания холестерола в липопротеинах низкой плотности в сыворотке крови крыс ферментативным методом 57
2.3.2.7.Определение содержания холестерола в липопротеинах высокой плотности в сыворотке крови крыс ферментативным методом
2.3.3. Определение концентрации белка в клеточной культуре линии НТС .58
2.3.4. Оценка величины экспрессии мРНК генов метаболизма липидов в клеточной культуре НТС и печени крыс .59
2.3.4.1. Выделение суммарной РНК из клеток гепатомы и печени крыс 59
2.3.4.2. Синтез комплементарной ДНК 61
2.3.4.3. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени по технологии TaqMan .62
2.3.5. Определение уровня активных форм кислорода в клеточной культуре линии НТС флуоресцентным методом .64
2.3.6. Определение содержания восстановленного глутатиона в клеточной культуре линии НТС флуоресцентным методом .65
2.3.7. Визуализация внутриклеточного содержания липидов, активных форм кислорода и восстановленного глутатиона в клеточной культуре линии НТС методом микроскопии .66
2.3.8. Статистическая обработка результатов 68
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение собственных исследований 69
3.1. Влияние сесквитерпенового лактона ахиллина на содержание триацилглицеролов и холестерола в клетках гепатомы линии НТС при экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной липофундином 69
3.1.1. Оценка цитотоксичности ахиллина на клеточной культуре линии НТС .70
3.1.2 Влияние ахиллина на флуоресценцию Nile Red в клеточной культуре линии НТС .71
3.1.3. Моделирование экспериментальной гиперлипидемии in vitro в клеточной культуре линии НТС 74
3.1.4. Влияние ахиллина на содержание триацилглицеролов и холестерола в клеточной культуре линии НТС при экспериментальной гиперлипидемии,индуцированной липофундином 77
3.2. Влияние сесквитерпенового лактона ахиллина на величину экспрессии мРНК ключевых генов метаболизма липидов при эксперментальной гиперлипидемии на клеточной культуре линии НТС .82
3.2.1. Изучение влияния ахиллина на величину экспрессии мРНК гена рецептора к липопротеинам низкой плотности (Ldlr) в клеточной культуре линии НТС .82
3.2.2. Изучение влияния ахиллина на величину экспрессии мРНК гена фермента 3-гидрокси-3-метилглютарил-КоА редуктазы (Hmgcr) в клеточной культуре линии НТС 85
3.2.3. Изучение влияния ахиллина на величину экспрессии мРНК гена фермента ацетилКоА: холестеролацилтрансферазы (Soat1) в клеточной культуре линии НТС .87
3.2.4. Изучение влияния ахиллина на величину экспрессии мРНК гена фермента 7-гидроксилазы (Cyp7a1) в клеточной культуре линии НТС 88
3.2.5. Изучение влияния ахиллина на величину экспрессии мРНК генов ферментов карнитин-пальмитоилтрансферазы I (Cpt1a) и II (Cpt2) в клеточной культуре линии НТС 90 3.2.6. Изучение влияния ахиллина на величину экспрессии мРНК гена фермента ацетил-КоА-карбоксилазы (Acaca) в клеточной культуре линии НТС .92
3.3. Влияние ахиллина на уровень активных форм кислорода и содержание восстановленного глутатиона в клеточной культуре линии НТС при экспериментальной гиперлипидемии 95
3.4. Гиполипидемическое действие ахиллина на фоне острой экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной этиловым спиртом 103
3.5. Гиполипидемическое действие ахиллина на фоне острой экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339 .108
3.6. Гиполипидемическое действие ахиллина на фоне хронической экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой 113
3.6.1. Влияние сесквитерпенового лактона ахиллина на величину экспрессии мРНК ключевых генов метаболизма липидов у крыс на модели гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой 121
Заключение .128
Выводы 138
Список сокращений и условных обозначений .140
Список литературы .
