Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Система свертывания крови 9
1.1.1. Тромбоциты и плазменный гемостаз 9
1.1.2. Генерация тромбина 11
1.1.3. Пространственный рост сгустка фибрина 12
1.1.4. Система фибринолиза 13
1.2. Контактный путь свертывания 14
1.2.1. Механизм контактной активации 14
1.2.2. Физиологическая роль контактной активации 16
1.2.3. Роль контактной активации в развитии патологий 18
1.2.4. Влияние фактора XII и контактной активации на систему свертывания 19
1.2.5. Эволюция контактного пути 23
1.3. Научно-практическое значение избирательного ингибирования контактного пути 24
1.3.1. Антикоагулянтное действие ингибиторов контактного пути 24
1.3.2. Исследование динамики свертывания по внешнему пути 25
1.4. Ингибиторы фактора XIIa 27
1.4.1. Инфестин-4 28
1.4.2. Кукурузный ингибитор трипсина 31
1.4.3. Ингибитор трипсина из тыквы CMTI-III 32
1.4.4. Создание новых ингибиторов фактора XIIа 34
1.4.5. Проблема эффективности ингибирования фактора XIIa 36
1.5. Канонический механизм ингибирования сериновых протеаз 37
1.5.1. Механизм расщепления пептидной связи в активном центре протеазы 38
1.5.2. Канонические ингибиторы 39
1.5.3. Факторы, определяющие конформацию и активность канонических ингибиторов 42
1.5.4. Неканонические механизмы ингибирования сериновых протеаз 45
1.6. Проблема избирательности ингибирования фактора XIIa 46
Постановка задачи 49
Глава 2. Материалы и методы 50
2.1. Реактивы и буферные растворы 50
2.2. Гетерологическая экспрессия ингибиторов фактора XIIa
2.2.1. Клонирование гена тыквенного ингибитора CMTI-III и создание различных систем экспрессии 52
2.2.2. Клонирование последовательностей и экспрессия вариантов инфестина-4 62
2.3. Компьютерное моделирование молекулярной динамики одиночных белков и белок белковый докинг 67
2.3.1. Молекулярная динамика ингибиторов фактора XIIа 67
2.3.2. Белок-белковый докинг ингибиторов с факторами XIIа, Xа и тромбином 68
2.4. Влияние ингибиторов фактора XIIа на систему свертывания 69
2.4.1. Определение констант ингибирования с помощью хромогенного теста 69
2.4.2. Оценка эффективности подавления контактной активации в плазме на основе теста активированного частичного тромбопластинового времени 71
2.4.3. Оценка влияния ингибиторов фактора XIIa на разные пути активации свертывания методом тромбодинамики 71
2.4.4. Постановка теста генерации тромбина 72
2.4.5. Исследование тромбоэластографии 73
2.4.6. Забор крови в пробирку, содержащую Мутант B в качестве антикоагулянта
2.5. Действие ингибиторов трансглутаминаз на тромбоциты с фосфатидилсерином 74
2.6. Статистический анализ 74
Глава 3. Результаты 75
3.1. Получение рекомбинантных ингибиторов фактора XIIa и изучение их свойств 75
3.1.1. Выбор наиболее эффективной системы экспрессии CMTI-III 75
3.1.2. Очистка слитого белка инфестина-4 и тиоредоксина и его расщепление 80
3.1.3. Селективность ингибирования фактора XIIa каноническими ингибиторами 82
3.2. Внесение мутаций в протеаза-связывающую петлю инфестина-4 85
3.2.1. Внесенные мутации способствуют стабилизации канонической конформации 85
3.2.2. Мутации повысили селективность инфестина-4 к фактору XIIa
3.3. Механизмы избирательного ингибирования фактора XIIa мутантами инфестина-4 91
3.4. Влияние селективных ингибиторов фактора XIIa на динамику свертывания в плазме
3.4.1. Мутант инфестина-4 специфически ингибирует контактный путь свертывания в плазме, свободной от тромбоцитов 95
3.4.2. Возможное научно-практическое применение Мутанта B 99
3.5. Ингибиторы трансглутаминаз регулируют формирование фосфатидилсерин положительных тромбоцитов, активирующих контактный путь 102
Глава 4. Обсуждение 104
Заключение 113
Выводы 114
Благодарности 115
Список сокращений и условных обозначений 116
Список литературы
