Введение
Глава 1. Введение 9
Глава 2. Обзор литературных данных
2.1. Экспериментальные подходы к моделированию ишемического повреждения нейронов головного мозга 20
2.1.1. Моделирование ишемии in vivo 21
2.1.2. Моделирование ишемии in vitro 24
2.2. Развитие ишемического повреждения нейронов головного мозга 26
2.2.1. Нейроцитотоксический эффект глутамата и роль митохондрий в его развитии 31
2.2.2. Депривация по глюкозе 36
2.2.3. Свободнорадикальное повреждение нейронов 45
2.2.4. Нарушение кислотно-щелочного равновесия
2.3. Роль глутамина в выживании и гибели нейронов 58
2.4. Фармакологическая защита нейронов от ишемического повреждения...66
2.5. Защита нейронов головного мозга от ишемического повреждения путем воздействия на эндогенные нейропротекторные системы 73
Глава 3. Материал и методы исследования
3.1. Объект исследования 76
3.2. Получение диссоциированных монослойных культур 76
3.3. Приготовление субстратов для культивирования 79
3.4. Схемы экспериментальных воздействий 79
3.4.1. Моделирование факторов ишемического повреждения нейронов in vitro 79
3.5. Приготовление препаратов для световой микроскопии 81
3.6. Методы количественного анализа культур и оценки выживаемости 82
3.7. Флуресцентная микроскопия
3.7.1. Определение внутриклеточных концентраций Са2+ и Zn2+ 84
3.7.2. Определение мембранного потенциала митохондрий с помощью родамина 84
3.7.3. Определение активных форм кислорода гидроэтидином 85
3.8. Электронная микроскопия 85
3.9. Количественное определение мРНК к ASICla методом ПЦР.
3.10. Фотоиндуцированный тромбоз 86
3.11. Фокальная компрессионная ишемия 87
3.12. Измерение объема очага ишемического повреждения 89
3.13. Условный рефлекс пассивного избегания 91
Глава 4. Результаты исследования
4.1. Морфология культивированных зернистых нейронов мозжечка 92
4.2. Цитотоксическое действие глутамата 95
4.2.1. Сравнительный анализ цитотоксического действия глутамата на зернистые нейроны в различные сроки культивирования 95
4.3. Нейродеструктивное действие глюкозной депривации 102
4.3.1. Жизнеспособность нейронов при глюкозной депривации 102
4.3.2. Изменения внутриклеточной концентрации ионов Са2+ ([Са2+],) и мембранного потенциала митохондрий при глюкозной депривации 103
4.3.3. Возрастание продукции активных форм кислорода в
культивированных зернистых нейронах при глюкозной депривации 104
4.3.4. Влияние митохондриальных ингибиторов на [Ca2+]i и продукцию активных форм кислорода при глюкозной депривации 105
4.3.5. Влияние рутениевого красного и пиру вата на изменение мембранного потенциала митохондрий при глюкозной депривации 107
4.3.6. Зависимость действия глюкозной депривации от степени морфохимической дифференцировки культивированных зернистых нейронов in vitro. Обратимость эффекта глюкозной депривации 108
4.4. Окислительный стресс 113
4.4.1. Цитотоксическое действие параквата на нейрохимически зрелые и незрелые культивированные зернистые нейроны и значение глутамина для развития цитотоксичности 113
4.4.2. Антиоксидантный статус культивированных зернистых нейронов в различные сроки культивирования 115
4.4.3. Влияние предобработки уабаином зрелых и незрелых культивированных зернистых нейронов на окислительный стресс и нейрональный апоптоз 116
4.5. Ацидоз 119
4.5.1. Влияние ацидоза на жизнеспособность нейронов 119
4.5.2. Механизмы действия ацидоза на незрелые культивированные зернистые нейроны 122
4.5.3. Исследование механизма защитного действия менадиона 127
4.6. Особенности действия глутамина на культивированные зернистые нейроны 129
4.6.1 Влияние глутамина на мембранный потенциал митохондрий зрелых культивированных зернистых нейронов при глюкозной депривации...129
4.6.2. Влияние глутамина на жизнеспособность зрелых культивированных зернистых нейронов в норме и условиях глюкозной депривации 130
4.6.3. Влияние пирувата на жизнеспособность культивированных зернистых нейронов при глюкозной депривации 132
4.6.4. Влияние глутамина на жизнеспособность зрелых культивированных зернистых нейронов при химической гипоксии, индуцированной ротеноном 132
4.6.5. Влияние глутамина на выживаемость и [Са2+]! незрелых культивированных зернистых нейронов при действии ротенона 134
4.6.6. Влияние глутамина на выживаемость и [Са2+], в незрелых культивированных зернистых нейронах при ингибированиии Na+/K+-АТРазы уабаином 136
4.6.7. Влияние глутамина на выживаемость, [Са2+], и мембранный
потенциал митохондрий незрелых культивированных зернистых нейронов при гиперстимуляции NMDA-рецепторов 138
4.6.8. Влияние глутамина на гибель культивированных нейронов коры головного мозга при ишемии, гипоксии, глюкозной депривации 141
4.7. Совместное действие повреждающих факторов ишемии 144
4.7.1. Паракват потенцирует токсическое действие глутамата в незрелых культивированных зернистых нейронах 144
4.7.2. Совместное действие ацидоза и параквата 145
4.7.3. Совместное действие стауроспорина и умеренного ацидоза 147
4.8. Защита нейронов от повреждения с применением нейропротекторов...148
4.8.1. Фармакологическая коррекция повреждения культивированных зернистых нейронов препаратами семейства SkQ in vitro 148
4.8.2. Влияние SkQRl на объем очага повреждения коры головного мозга крысы, индуцированного компрессионной ишемией 154
4.8.3. Фармакологическая коррекция повреждения культивированных зернистых нейронов при моделировании ишемии in vitro с помощью препарата целлекс 156
4.8.4. Изменение объема ишемического очага, индуцированного фототромбозом, при действии целлекса 159
4.8.5. Фармакологическая коррекция повреждения культивированных зернистых нейронов с помощью препарата ГК-2 162
4.8.6. Изменение объема очага ишемического повреждения фотоиндуцированным тромбозом при действии ГК-2 163
Глава 5. Обсуждение результатов
5.1. Диссоциированные культуры клеток головного мозга как объект исследования механизмов ишемического повреждения нейронов 168
5.2. Исследование механизмов патологических процессов, вызываемых ишемическим повреждением культивированных нейронов 171
5.2.1. Механизмы цитотоксического повреждения нейронов, вызываемого глутаматом 171
5.2.2. Механизмы повреждения нейронов при глюкозной недостаточности 176
5.2.3. Обратимость морфофункциональных изменений
культивированных зернистых нейронов при глюкозной депривации...180
5.2.4. Ацидоз 182
5.2.5. Окислительный стресс 186
5.2.6. Влияние глутамина на повреждение нейронов
5.3. Сравнение токсического воздействия на зернистые нейроны различных сроков культивирования 192
5.4. Заключение по разделу 196
5.5. Защита головного мозга от ишемического повреждения 198
5.5.1. Индукция неиропротекции транзиторным снижением активности Ыа+/К+-АТРазы 198
5.5.2. Использование новых препаратов для защиты нейронов от ишемического повреждения 199
5.6. Заключение 207
6. Выводы 212
7. Список цитированной литературы
