Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Агрегация белков 8
1.2. Бычий сывороточный альбумин (БСА) 13
1.3. Альфа-лактальбумин (ЛА) 18
1.4. Глутаматдегидрогеназа (ГД) 21
1.5. Альфа-кристаллин 25
1.6. Химические шапероны 30
1.6.1.Аргинин 30
1.6.2. Производные аргинина 37
1.6.3. Пролин 38
2. Материалы и методы исследования 40
2.1. Материалы 40
2.1.1. Бычий сывороточный альбумин 40
2.1.2. -Лактальбумин 40
2.1.3. Глутаматдегидрогеназа 40
2.1.4. -Кристаллин 41
2.1.5. Реактивы 41
2.2. Методы исследования 41
2.2.1. Выделение -кристаллина 41
2.2.2. Получение сшитого -кристаллина 42
2.2.3. Получение денатурированного неагрегированного БСА 42
2.2.4. Динамическое светорассеяние 43
2.2.5. Изучение кинетики агрегации белков 45
2.2.6. Дифференциальная сканирующая калориметрия 47
2.2.7. Фракционирование в поле асимметричного потока (AF4) 49
2.2.8. Аналитическое ультрацентрифугирование 52
2.2.9. УФ-облучение препарата -кристаллина 2.2.10. Гель-проникающая хроматография 55
2.2.11. ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле 55
2.2.12. Определение показателя преломления, плотности и динамической вязкости..56
2.2.13. Измерение флуоресценции 56
2.2.14. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) 57
2.2.15. Спектроскопия кругового дихроизма (КД) 58
2.2.16. Измерение дзета-потенциала 59
2.2.17. Вычисления 59
3. Результаты и обсуждение 60
3.1. Теория. Количественная оценка шапероноподобной активности 60
3.1.1. Определение начальной скорости агрегации белка 60
3.1.2. Оценка антиагрегационной активности химических шаперонов 63
3.1.3. Оценка антиагрегационной активности белковых шаперонов 64
3.1.4. Классификация тест-систем, используемых для оценки антиагрегационной активности шаперонов 66
3.2 Экспериментальные результаты 70
3.2.1. Механизм тепловой агрегации БСА 70
3.2.2. Влияние химических шаперонов на тепловую агрегацию БСА 96
3.2.3. Кинетический режим индуцированной дитиотреитолом (ДТТ) агрегации БСА 102
3.2.4. Оценка шапероноподобной активности пролина и производных аргинина с использованием тест-системы на основе ДТТ-индуцированной агрегации БСА 109
3.2.5. Сравнение шапероноподобной активности интактного и сшитого -кристаллина с использованием тест-системы на основе ДТТ-индуцированной агрегации БСА...114
3.2.6. Кинетика ДТТ-индуцированной агрегации -лактальбумина 122
3.2.7. Оценка шапероноподобной активности УФ-облученного -кристаллина с использованием тест-системы на основе ДТТ-индуцированной агрегации -лактальбумина 129
3.2.8. Скрининг агентов, оказывающих влияние на стабильность белков с использованием тест-систем, основанных на агрегации белков в режиме нагревания с постоянной скоростью. 139
Влияние лигандов на тепловую агрегацию глутаматдегидрогеназы
Заключение 147
Выводы 149
Список публикаций по теме диссертации 151
Список литературы 153
