Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Физиологическая роль аконитатгидратазы и изоцитратлиазы .12
1.1.1. Физиологическая роль аконитатгидратазы .12
1.1.1.1. Обзор роли цитрата и аконитатгидратазы в основных путях энергетического метаболизма .12
1.1.1.2. Характеристика фермента аконитатгидратазы .19
1.1.1.3. Локализация и изоферментный состав аконитазы 24
1.1.2. Физиологическое значение изоцитратлиазы 26
1.1.2.1. Обзор роли изоцитратлиазы в основных метаболических путях .26
1.1.2.2. Характеристика фермента изоцитратлиазы .27
1.1.2.3. Локализация и изоферментный состав изоцитратлиазы .28
1.2. Физико-химические и регуляторные особенности аконитатгидратазы и изоцитратлиазы 29
1.2.1. Физико-химические и регуляторные свойства аконитатгидратазы 29
1.2.1.1. Очистка аконитазы 29
1.2.1.2. Молекулярная масса аконитазы из разных объектов 30
1.2.1.3. Каталитические свойства аконитатгидратазы 31
1.2.1.4. Активаторы аконитазы 33
1.2.1.5. Ингибиторы аконитазы 35
1.2.1.6. Механизм действия фермента 35
1.2.2. Физико-химические и регуляторные характеристики изоцитратлиазы 37
1.2.2.1. Очистка изоцитратлиазы 37
1.2.2.2. Молекулярная масса изоцитратлиазы из разных объектов .38
1.2.2.3. Каталитические свойства 39
1.2.2.4. Активаторы изоцитратлиазы .39
1.2.2.5. Ингибиторы изоццитратлиазы 40
1.2.2.6. Механизм действия изоцитратлиазы 40
1.3. Молекулярные аспекты функционирования аконитатгидратазы и изоцитратлиазы .41
1.3.1. Молекулярные аспекты функционирования аконитатгидратазы 41
1.3.2. Молекулярные аспекты функционирования изоцитратлиазы 47
Глава 2. Экспериментальная часть 51
2.1.Объекты и методы исследования 51
2.1.1. Объекты исследования 51
2.1.2. Методы исследования .52
2.1.2.1. Определение активности изоцитратлиазы 52
2.1.2.2. Определение активности аконитатгидратазы 52
2.1.2.3. Выделение и очистка изоцитратлиазы 53
2.1.2.4. Выделение и очистка аконитатгидратазы .53
2.1.2.5. Определение концентрации белка 54
2.1.2.6. Электрофоретические исследования белков 55
2.1.2.6.1.Определение гомогенности ферментов .55
2.1.2.6.2. Специфическое проявление изоцитратлиазы 56
2.1.2.6.3. Специфическое проявление аконитатгидратазы 56
2.1.2.7. Субклеточная локализация .57
2.1.2.8. Регуляция изоцитратлиазы 58
2.1.2.9. Регуляция аконитатгидратазы 58
2.1.2.10. Идентификация генов aco1, aco2, icl1 и icl2 и их экспрессия 58
2.1.2.10.1. Выделение суммарной клеточной популяции РНК 58
2.1.2.10.2. Обратная транскрипция 59
2.1.2.10.3. Подбор праймеров .59
2.1.2.10.4. Проведение ПЦР в реальном времени .60 2.1.2.11. Статистическая обработка данных .61 2.2. Результаты и их обсуждение 63
2.2.1. Изоферментный состав аконитатгидратазы из растений с различным типом метаболизма .63
2.2.2. Изоферментный состав изоцитратлиазы из растений с различным типом метаболизма .66
2.2.3. Внутриклеточное распределение аконитазной и изоцитратлиазной активностей в тканях кукурузы .70
2.2.4. Внутриклеточное распределение аконитазной и изоцитратлиазной активностей в тканях амаранта 73
2.2.5. Внутриклеточное распределение аконитазной и изоцитратлиазной активностей в тканях сои 77
2.2.6. Очистка аконитатгидратазы из кукурузы 80
2.2.7. Исследование гомогенности и специфической активности аконитатгидратазы из кукурузы 82
2.2.8. Выделение и очистка аконитазы из сои 83 .
2.9.Исследование гомогенности препаратов аконитатгидратазы, очищенных из сои .84
2.2.10. Очистка аконитатгидратазы из амаранта 85
2.2.11. Электрофоретические исследования аконитатгидратазы из амаранта на гомогенность и специфическую активность .86
2.2.12. Сравнительный анализ этапов очистки аконитазы из различных растений .87
2.2.13. Анализ основных показателей очищенных препаратов изоцитратлиазы из различных растений 89
2.2.14. Электрофоретические исследования препаратов изоцитратлиазы, очищенных из кукурузы, сои и амаранта 90
2.2.15. Метаболитная регуляция активности аконитатгидратазы и изоцитратлиазы в растениях 93
2.2.15.1. Ингибирование функционирования изоферментов аконитатгидратазы транс-аконитатом 93
2.2.15.2. Регуляция активности аконитатгидратазы органическими кислотами .97
2.2.15.3. Действие интермедиатов глюконеогенеза на активность изоцитратлиазы 100
2.2.15.4. Влияние органических кислот на функционирование изоцитратлиазы из разных растений .103
2.2.16. Воздействие перекиси водорода на активность аконитатгидратазы .104
2.2.17. Регуляция активности изоферментов изоцитратлиазы перекисью водорода .109
2.2.18. Экспрессионная регуляция аконитазной и изоцитратлиазной активности при прорастании растений .109
2.2.18.1. Выделение тотальной клеточной РНК из кукурузы и амаранта и получение ее кДНК .110
2.2.18.2. Исследование экспрессии генов aco1 и aco2 при прорастании семян кукурузы 111
2.2.18.3. Исследование экспрессии генов aco1 и aco2 при прорастании семян амаранта 114
2.2.18.4. Экспрессия генов изоцитратлиазы в проростках семян
амаранта .115
Заключение .121
Выводы .124
Список использованных источников .
