Введение
Глава I. Микроспектральные исследования БАС: Современное состояние проблемы 9
1.1. Методы исследования БАС на основе микроскопии и флуоресценции 10
1.2. Микроспектрофлуориметры 14
1.3. Развитие метода МСФ и его применения 19
1.3.1. Исследования ксенобиотиков в живых клетках с помощью МСФ 19
1.3.1.1. МСФ-исследования полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) 21
1.3.1.2. МСФ в исследованиях лекарств против псориаза 24
1.3.1.3. МСФ в исследованиях противоопухолевых соединений 24
1.3.2. МСФ в измерениях внутриклеточных концентраций свободных ионов 30 кальция и магния
1.3.3. Метод МСФ в исследованиях ФС 34
1.3.4. Анализ методом МСФ собственной флуоресценции клеток 36
1.3.5. Некоторые другие исследования с применением метода МСФ 40 Глава И. Приборное обеспечение и разработка метода КОМИРСИ 45 II. 1. Приборное обеспечение для конфокальной сканирующей микроспектроскопии 45 II. 1.1. Конфокальный сканирующий микроспектрометр фирмы Dilor 45 П. 1.1.1. Спектрометр 46 И. 1.1.2. Микроскоп 48 II. 1.1.3. Входная конфокальная камера и принцип линейного сканирования 49 И. 1.1.4. Программное обеспечение 52
1.1.2. Разработка лабораторной экспериментальной установки для конфокальной сканирующей микроспектроскопии
II.2. Разработка метода КОМИРСИ 65
Н.2.1. Идентификация и изучение молекулярных взаимодействий БАС в живых 67
клетках методом КОМИРСИ
П.2.2. Проблема собственной клеточной флуоресценции и ее решение методом 73
КОМИРСИ
II.2.3. Измерение концентрации БАС и их комплексов в живых клетках методом 77
КОМИРСИ
П.2.4. Применение метода КОМИРСИ для выявления органоидов, в которых 87
происходит преимущественное накопление исследуемых БАС
II.2.5. Исследования распределения БАС в срезах тканей методом КОМИРСИ 95
П.2.6. Преимущества и ограничения метода КОМИРСИ в исследованиях БАС 101
Глава III. Материалы и методики 102
II 1.1. Реактивы 102
Ш.2. Исследование молекулярных взаимодействий БАС в растворах 104
Ш.З. Измерение генерации активных форм кислорода 106
Ш.4. Оценка фотостабилыюсти ЦИХЛ и ЦИБХЛ 107
111.5. Эксперименты на культуре клеток 108
111.6. Методики, применявшиеся при изучении внутриклеточной локализации БАС 109 Ш.7. Методики исследования цитотоксического воздействия БАС 112
III.8. Приготовление криостатных срезов тканей 115
Ш.9. Приборное и программное обеспечение экспериментов 116
Глава IV. Исследования БАС с применением метода КОМИРСИ 117
IV. 1. Исследования митоксантрона 118
IV. 1.1. Исследование молекулярных взаимодействий МИТО в растворах 118
IV. 1.2. Анализ внутриклеточных спектров МИТО 122
IV. 1.3. Количественный анализ МИТО и его комплексов в клетках К562 125
IV. 1.4. Особенности внутриклеточного накопления и распределения МИТО на разных стадиях клеточного цикла
IV. 1.5. Особенности накопления и распределения МИТО в клетках K562R с 136
множественной лекарственной устойчивостью
IV.2. Исследование сульфированного фталоцианина в живых клетках и срезах тканей
IV.2.1. Молекулярные свойства сульфированного фталоцианина 141
IV.2.2. Накопление и распределение H2PCS2.4 в живых раковых клетках, как основа его фотодинамической активности 144
IV.2.3. Распределение H2PCS2.4 в опухолевых тканях 146
IV.2.3.1. Гистологический анализ особенностей роста опухолей 146
IV.2.3.2. Распределение H2PCS2.4 в срезах тканей 149
IV.3. Сравнительное исследование свойств ФС хлоринового ряда 155
IV.3.1. Исследования З-дезвинил-3-формилхлорина рб 157
IV.3.1.1. Молекулярные свойства ФХрб 158
IV.3.1.2. Исследования ФХрб в живых клетках 160
IV.3.2. Циклоимидные производные хлорина рб (ЦИХЛ) 165
IV.3.2.1. Растворимость, спектры поглощения и флуоресценции ЦИХЛ 165
IV.3.2.2. Исследование молекулярных взаимодействий ЦИХЛ в растворах 169
IV.3.2.3. Исследование внутриклеточного распределения и локализации ЦИХЛ 174
IV.3.2.4. Особенности внутриклеточных спектров флуоресценции ЦИХЛ 182
IV.3.2.5. Особенности клеточного накопления и выведения ЦИХЛ 186
IV.3.2.6. Исследование механизмов клеточного транспорта ЦИХЛ 188
IV.3.2.7. Фотоиндуцированная цитотоксичность ЦИХЛ и ее сопоставление со свойствами ЦИХЛ
IV.3.2.8. Механизмы ЦИХЛ-опосредованной фотоиндуцированной гибели клеток 196
IV.3.2.9. Распределение ЦИХЛ в тканях мышей с перевивной опухолью Р388 199
IV.3.2.10. ФДТ с использованием соединений 1 и 5 203
IV.3.2.11. Сравнительный анализ данных метода КОМИРСИ о распределении ЦИХЛ в тканях и результатов ФДТ
IV.4. Исследование свойств фотосенсибилизаторов на основе циклоимидных производных бактериохлорина
IV.4.1. Растворимость, спектры поглощения и флуоресценции ЦИБХЛ 209
IV.4.2. Исследование молекулярных взаимодействий ЦИБХЛ в растворах 211
IV.4.3. Исследование внутриклеточного распределения и локализации ЦИБХЛ 214
IV.4.4. Особенности клеточного накопления и выведения ЦИБХЛ 219
IV.4.5. Исследование механизмов клеточного транспорта ЦИБХЛ 222
IV.4.6. Фотоиндуцированная цитотоксичность ЦИБХЛ и ее сопоставление со свойствами ЦИБХЛ
IV.4.7. Влияние ЦИБХЛ-опосредованного фотодинамического воздействия на состояние митохондрий, лизосом и липидного транспорта
IV.4.8. Распределение ЦИБХЛ в тканях мышей с перевивной опухолью Р388 228
Заключение 231
Выводы 236
Благодарности 237
Список использованных сокращений
