Введение
Глава 1. Общая характеристика работы 6
1.1. Актуальность проблемы 6
1.2. Задачи исследования 8
1.3. Научная новизна проведенных исследований 9
1.4. Практическая ценность 10
1.5. Апробация работы 10
Глава 2 11
2.1. Супероксиддисмутаза как один из ключевых компонентов системы защиты клеток и тканей от окислительного стресса 11
2.2. Регуляция активности СОД на различных уровнях организации 14
2.3. РНК-интерференция и косупрессия 16
2.4. Малые РНК растений 18
2.5. siPHK растений 21
2.5.1. Механизм продукции и функции siPHK 21
2.5.2. Биологическая роль siPHK 23
2.6. МиРНК растений 23
2.7. Процессинг миРНК растений 27
2.8. Эволюция растительных МИР генов 32
2.9. Применение РНК-интерференции 38
Глава 3. Материалы и методы 41
3.1. Объекты исследований 41
3.2. Проведение молекулярных анализов 45
3.2.1. Выделение тотальной РНК из растительного материала фенол-хлороформным методом для определения уровня экспрессии микроРНК 45
3.2.2. Нозерн-блот анализ для детекции коротких РНК с ДНК-олигонуклеотидом 46
3.2.3. Очистка тотальной РНК от примесей ДНК для проведения ОТ-ПЦР 49
3.2.4. Обратная транскрипция 49
3.2.5. Подбор праймеров для проведения обратной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и зондов для Нозерн-блот гибридизации 50
3.2.6. Условия проведения ПЦР-анализа 50
3.2.7. Подготовка проб для секвенирования нуклеотидных последовательностей генов 54
3.3. Проведение вестерн-блот анализа 54
3.3.1. Экстракция белков из тканей растения 54
3.3.2. Проведение электрофореза в полиакриламидном геле 56
3.4. Математическая обработка данных 58
Глава 4. Результаты и обсуждение 59
4.1. Разработка методических подходов для исследования экспрессии miR398 59
4.2. Анализ уровня экспрессии семейства miR398 у 77г. salsuginea при действии NaCl, света высокой интенсивности и UV-B облучения 63
4.2.1. Экспрессия miR398 и гена CSD1 при действии NaCl 63
4.2.2. Экспрессия miR398 и гена CSD1 при действии света высокой интенсивности 66
4.2.3. Экспрессия miR398 и гена CSD1 при действии UV-B облучения. 68
4.3. Исследование экспрессии miR398 в каллусной культуре 71
77г. salsuginea 71
4.4. Исследование влияния различных концентраций меди в питательной среде растений Th. salsuginea на экспрессию генов МИР 398, CSD1 и CCS1 73
4.5. Исследование влияния различных концентраций меди в питательной среде растений 77г. salsuginea на содержание белков CSD1 и CCS1 79
4.6. Исследование экспрессии генов Argonaute, DCL1, DDR1, SPL7, связанных с процессингом miR398 в растении 77г. salsuginea. 81
4.7. Обсуждение 85
Заключение: 91
Выводы 95
Список литературы
