Введение
2 Обзор литературы 11
2.1 Аффинная хроматография как важнейший метод аналитической и препаративной биосепарации 11
2.2 Современные стационарные фазы для динамических процессов, основанных на аффинных взаимодействиях 12
2.2.1 Традиционные пористые носители (высокопроницаемые частицы) 13
2.2.2 Непористые сорбенты 15
2.2.3 Перфузионные или гигапористые носители 16
2.2.4 Непрерывные разделительные слои (сорбенты монолитного типа)... 19
2.2.5 Тонкие мембраноподобные слои 21
2.3 Макропористые полимерные сорбенты 29
2.3.1 Особенности синтеза 29
2.3.2 Морфология поровой структуры 34
2.3.3 Функционализация поверхности посредством иммобилизации аффинных лигандов 37
2.4 Особенности аффинного комплексообразования в растворе и с участием неподвижной фазы (сорбента) 43
2.4.1 Определение количественных характеристик специфического комплексообразования с использованием подхода аффинной хроматографии 44
2.4.2 Аффинные лиганды: лиганды высокой специфичности и общеспецифические аффинные лиганды 47
2.5 Проточные биореакторы на основе комплементарного связывания 51
2.6 Синтез пептидов, катализируемый иммобилизованными ферментами.54
2.7 Использование макропористых метакрилатных дисков монолитного типа в качестве носителей для твердофазного синтеза пептидов 58
3 Обсуждение результатов 62
3.1 Анализ поровой структуры монолитных сорбентов динамическим методом 62
3.2 Ковалентная иммобилизация биологически активных лигандов на ГМА-ЭДМА дисках 65
3.2.1 Влияние внешних параметров процесса, осуществляемого в статических условиях, на эффективную адсорбционную емкость сорбента 66
3.2.2 Сравнение процессов иммобилизации белков и пептидов, осуществляемых в статических и динамических условиях 69
3.2.3 Влияние промежуточного спейсера на количественные характеристики аффинных взаимодействий 72
3.3 Влияние внешних условий на параметры аффинных взаимодействий, реализованных на монолитных носителях 77
3.3.1 Зависимость эффективности аффинного связывания от скорости подвижной фазы (зональное элюирование) 77
3.3.2 Использование фронтального анализа для сравнения аффинного комплексообразования при различных скоростях подвижной фазы 79
3.3.3 Влияние поверхностной концентрации иммобилизованного лиганда на аффинные параметры исследуемых пар 84
3.3.4 Влияние температуры на термодинамическую прочность аффинных комплексов 85
3.4 Практические приложения исследованных процессов, основанных на межфазовом распределении вещества 87
3.4.1 Аффинное фракционирование пулов поликлональных антител 87
3.4.2 Создание проточного ферментативного биореактора на основе химотрипсина, иммобилизованного на ГМА-ЭДМА монолитных дисках 95
3.4.3 Прямой синтез адсорбционных лигандов на макропористых монолитных носителях (ГМА-ЭДМА дисках) с использованием подхода твердофазного пептидного синтеза (ТФПС) 107
4.Экспериментальная часть 114
4.1 Материалы и приборы 114
4.2 Методы 117
4.2.1 Ковалентное связывание лигандов с монолитными стационарными фазами 117
4.2.2 Высокоэффективная монолитная дисковая аффинная хроматография (ВЭМДАХ) 120
4.2.3 Количественное определение параметров аффинного взаимодействия методом фронтального элюирования 122
4.2.4 Мультифункциональная иммуноаффинная хроматография 122
4.2.5 Приготовление сывороток антител .123
4.2.6 Твердофазный пептидный синтез (ТФПС) 123
4.2.7 Синтез конъюгата БК-С-БСА 126
4.2.8 Иммуноферментный анализ 127
4.2.9 Ферментативный гидролиз 1Ч-бензоил-Ь-тирозин этилового эфира (БТЭЭ) и бычьего сывороточного альбумина (БСА) 129
4.2.10Анализ продуктов ферментативного гидролиза БСА с использованием метода капиллярного электрофореза 130
4.2.11 Ферментативный синтез дипептида BocLeuPheOMe с использованием химотрипсина, иммобилизованного на ГМА-ЭДМА диске 131
4.2.12Химический синтез аминокислотных производных BocLeuOMe, PheOMe и дипептида BocLeuPheOMe 131
4.2.13Твердофазный пептидный синтез на ГМА-ЭДМА дисках 133
4.2.14Гель-электрофоретический анализ ВЭМДАХ элюатов, содержащих тканевый активатор плазминогена (ТАЛ) 135
Выводы 138
Список литературы 140
Приложения 153
