Введение
I. Аппарат транскрипции у эукариот 8
1 Транскрипция у эукариот. РНК-полимеразы 8
2. РНК-полимераза II. 9
3. Области контроля транскрипции 10
Промотор 10
Проксимальные и дистальные элементы. Энхансеры 13
LCR.MAR 15
4. Инициация mpancKpumfUU РНК-полимеразой II 16
II. Транскрипционные факторы 19
1. Компоненты транскрипционного аппарата 19
2. Общие факторы транскрипции (GTFs) 21
ТВР 21
TFIIB 23
TFIIF 23
TFIIH 23
TFIIE 24
TFIIA 24
3. Активаторы и репрессоры 24
ДНК-связывающие домены 26
Активациониые и репрессионные домены 26
4. Корегуляторы 27
TFIID 29
TAFs 30
USA 33
Медиатор 34
III. ХРОМАТИН 36
1. Хроматин и транскрипция 36
2. Гетерохроматин иэухроматин 38
3. Хроматин-ремоделирующие комплексы 40
SWI/SNF группа 40
ISWI группа 41
NuRD 42
Механизмы ремоделинга хроматина 42
4. Хроматии-модифихщрующие комплексы 43
Гистоновый код 43
Гистонацетилтрансферазы 45
SAGA 47
СВР. р 160 семейство 48
Гистондеацетилазы 49
5. Взаимодействие хроматин-ремоделирущих и модифицирующих комплексов 50
IV. Функционирование аппарата транскрипции IN VIVO 50
1. Модульная структура транскрипционного аппарата 50
PHD 51
AT-hook 53
2. Комбинаторная модель регуляции транскритии. Синергизм действия и контекст-зависимая активность факторов транскрипции 54
3. Регуляция транскрипции 57
4. Регуляция активности транскрипционных факторов 58
5. Репрессия транскрипции и сайленсинг 60
6. Инициация транскрипции in vivo 62
7 Организация ядра и траискрит^ия 66
Экспериментальная часть 69
I. Объект и задачи исследования 69
Ii. Материалы и методы 72
1. Реактивы 72
2. Работа с дрозофилами 72
3. Программное обеспечение. Базы данных. 72
4. Работа с ДНК 72
Приготовление компетентных клеток и трансформация. Выделение плазмидной ДНК, Рестрикция, лигировапие, переосаждение ДНК, гель-электрофорез 72
PCR 73
Секвепирование ДНК 75
Секвенирование летального аллеля 75
Саузерн-гибридизация , 75
Введение радиоактивной метки в ДНК-зонд 76
Клонирование гена е(у)3 76
5. Работа с РНК 76
Выделение тотальной РНК 76
Очистка polyA+РНК 76
Получение кДНК, RT-PCR 76
Нозери анализ 77
6. Работа с белками 78
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков 78
Получение антител и их очистка 78
Белковый гель-электрофорез 79
Иммуноблоттинг 79
Иммунопреципитация 79
Dot-blot 80
Выделение эмбрионального ядерного экстракта 80
Фракционирование ядерных белков 80
Получение белковых экстрактов из эмбрионов , 80
Хроматография , 80
7. Гибридизация in situ 80
Гибридизация срезов in situ 80
Гибридизация политенных хромосом in situ 80
8. Иммуиоокрашивание 81
Иммуноокрашивание политенных хромосом 81
Иммуиоокрашивание ядер с удаленным хроматином 81
Иммуноокрашивание срезов 81
Иммуноокрашивание эмбрионов 81
III. РЕЗУЛЬТАТЫ 82
1. Геномная характеризация гена e(y)3 82
Клонирование гена е(у)3 82
Изучение структуры гена е(у)3 82
Геномная характеризация аллеля е(у)Зи 83
Получение и характеризация новой мутации е(у)3 83
Картирование других мутаций гена е(у)3 83
2. Изучение структуры транскриптов гена е(у)3 . 85
Изучение структуры с помощью Нозерн-гибридизации 85
Картирование с помощью RT-PCR 85
Изучение структуры транскриптов у мутантов е(у)Зи1 и е(у)3ЕШ1 85
ESTs изучаемого гена , . 86
3. Структурный анализ SAYP 89
Анализ первичной структуры SAYP . 89
Гомологи SAYP. Консервативный домен SAY 90
Получение антител к белку , , 91
Иммуноблоттинг , , 91
Внутриядерное распределение SAYP 92
4. Анализ экспрессии гена е (у)3 98
Нозерн развития 98
Нозерн тканей , 98
Гибридизация in situ 98
Иммуноокрашивание срезов тканей 98
Иммуноокрашивание эмбрионов и личинок 98
5. Участие SAYP в транскрипции 103
Локализация на политенных хромосомах 103
Хроматографическая очистка 103
СоГР 104
IV. Обсуждение результатов 109
Выводы 117
Благодарности 118
Список литературы
