Введение
1. Обзор литературы 17
1.1. Развитие женских половых клеток 17
1.2. Раннее эмбриональное развитие млекопитающих 26
1.2.1. Оплодотворение 26
1.2.2. Слияние генетического материала млекопитающих 29
1.2.3. Активация зиготического генома 31
1.2.4. Приготовление к дроблению 35
1.2.5. Выход из блестящей оболочки 37
1.3. Морфология ядрышек эмбрионов мыши на стадии зиготы 39
1.4. Транскрипционная активность ПЯ в ранних преимплантационных эмбрионах мыши 40
1.5. Анализ молекулярного состава ПЯ в преимплантационных эмбрионах мыши 43
1.6. Участие предшественников ядрышек в пространственной организации хромосом в одноклеточных эмбрионах 44
1.7. Участие предшественников ядрышек в формировании хромоцентров 47
1.8. Ассоциация предшественников ядрышка в течение первого клеточного цикла после оплодотворения 48
2. Материалы и методы 50
2.1. Лабораторное оборудование 50
2.2. Реактивы 51
2.3. Антитела 52
2.4. Культура клеток 54
2.4.1. Окрашивание фибробластов NIH/3Т3 РНК-связывающим красителем пиронином Y и белок-связывающим красителем ФИТЦ 54
2.4.2. Иммуноцитохимическое выявление белков ядрышка в фибробластах NIH/3T3 54
2.4.3. Иммуноцитохимическое окрашивание фибробластов NIH/3T3 после фиксации 70%-ным этанолом 55
2.4.4. Выявление рРНК в эмбриональных фибробластах мыши линии NIH/3T3 методом флуоресцентной гибридизации in situ 56
2.5. Лабораторные животные 57
2.6. Гормональная стимуляция мышей и получение ооцитов и эмбрионов 58
2.7. Прижизненное окрашивание эмбрионов и ооцитов Hoechst 33342 59
2.8. Окрашивание эмбрионов мыши красителями пиронином Y и ФИТЦ 59
2.9. Иммунофлуоресцентное окрашивание эмбрионов мыши антителами к ядрышковым белкам после фиксации ПФА и обработки протеиназой К 60
2.10. Иммунофлуоресцентное окрашивание эмбрионов мыши антителами к белкам ядрышка после фиксации 70%-ным этиловым спиртом 61
2.11. Выявление рРНК в преимплантационных эмбрионах мыши методом флуоресцентной гибридизации in situ 62
2.12. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 63
2.13. Прижизненные наблюдения 63
2.13.1. Цейтраферная видеосъемка зигот мыши 63
2.13.2. Цейтраферная видеосъемка GV ооцитов мыши 64
2.13.3. Определение положения ядра в GV ооцитах мыши 65
2.13.4. Расчет расстояния и скорости движения ядер, ЯПТ GV ооцитов и ПЯ зигот 66
3. Результаты 67
3.1. Оптимизация условий выявления РНК и белков в фибробластах мыши NIH/3T3 c помощью флуоресцентных красителей, антител к ядрышковым белкам и зондов к рРНК 67
3.1.1. Оптимизация условий выявления РНК в фибробластах мыши пиронином Y 67
3.1.2. Оптимизация условий для выявления белка в фибробластах мыши с помощью ФИТЦ 69
3.1.3. Выявления ядрышковых белков в фибробластах NIH/3T3 с помощью иммуноцитохимического окрашивания антителами без обработки, после инкубации с протеиназой К и фиксации 70 % этиловым спиртом 69
3.1.4. Оценка специфичности олигонуклетидных зондов к рРНК в фибробластах мыши NIH/3T3 3.2. Цитохимическое выявления РНК и белков в зрелых ооцитах и эмбрионах мыши до имплантации 74
3.3. Иммуноцитохимическое выявление белков ядрышка в эмбрионах мыши 78
3.4. Выявление рРНК в эмбрионах мыши методом FISH 83
3.5. Анализ числа ПЯ на разных стадиях зиготы 86
3.6. Прижизненные наблюдения 88
3.6.1. Цейтраферная видеосъемка зигот мыши 88
3.6.2. Характер динамики движения ЯПТ GV ооцитов мыши. Движение многочисленных ЯПТ в составе ооцита 90
3.6.3. Характер движения ядер в GV ооцитах NSN- и SN-типа 92
4. Обсуждение 97
4.1. Ядрышковые компоненты ПЯ эмбрионов мыши 97
4.2. Динамика движения ПЯ эмбрионов мыши в течение первого клеточного цикла после оплодотворения 103
4.3. Динамика движения ядер GV ооцитов мыши 106
5. Заключение 108
6. Выводы 109
Список литературы 111
