Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Особенности хеликобактерной инфекции 11
1.1.1 . Микробиологическая характеристика Helicobacter pylori 11
1.1.2. Факторы патогенности Helicobacter pylori 14
1.1.2.1. Уреаза 17
1.1.2.2. Продукт гена IceA 18
1.1.2.3. Вакуолизирующий цитотоксин 18
1.1.2.4. Остров патогенности Helicobacter pylori 21
1.1.2.5. Другие факторы патогенности 23
1.2. Эпидемиология инфекции Helicobacter pylori 24
1.3. Лабораторная диагностика хеликобактериоза 27
1.3.1. Бактериологический метод 30
1.3.2. Морфологическая группа методов 32
1.3.3. Быстрый уреазный тест 34
1.3.4. Уреазные дыхательные тесты 35
1.3.5. Серологический метод 36
1.3.6. Молекулярно-генетические методы 39
1.3.6.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Методики подготовки клинических проб к проведению ПЦР 48
2.1.1. Подготовка клинических проб к проведению ПНР методом кипячения 48
2.1.3. Подготовка клинических проб к проведению ПНР методом, предложенным Марковой Г.А. и соавт. (1994) - полный вариант 49
2.1.4. Способы выделения ДНК из клинического материала, основанные на неферментативном лизисе исследуемого материала с последующим связыванием выделенной ДНК с сорбентом 50
2.1.4.1. Выделение ДНК с помощью набора «ДНК-сорб А» 51
2.1.4.2. Выделение ДНК с помощью набора «ДНК-сорб Б» 52
2.1.5. Методика выделения ДНК из парафинизированных срезов 52
2.2. Проведение ПЦР-амплификации фрагмента генома Helicobacter pylori... 52
2.2.1. Проведение ПЦР-амплификации гена 16SpPHK Helicobacter
pylori с использованием тест-системы «Helicobacter» 52
2.2.2. Проведение ПЦР-амплификации гена 16SpPHK Helicobacter pylori с использованием тест-системы «АмплиСенс-Helicobacter pylori-520» 53
2.2.3. Проведение ПЦР-амплификации гена UreC Helicobacter pylori с использованием тест-системы «Хеликопол II» 54
2.2.4. Проведение ПЦР-амплификации гена CagA Helicobacter pylori с помощью тест-системы «ДиаГен-Helicobacter» 55
2.2.5. Проведение ПЦР-амплификации гена VacA Helicobacter pylori с использованием набора «Хеликопол VA» 56
2.3. Пост-ПЦР обработка продуктов амплификации с помощью урацил-ДНК-гликозилазы 57
2.4. Метод гетеродуплексного анализа фрагмента гена CagA Helicobacter pylori 57
2.5. Методы регистрации результатов 58
2.5.1. Электрофорез продуктов амплификации в агарозном геле 58
2.5.1.1. Приготовление агарозного геля 58
2.5.1.2. Проведение электрофореза в агарозном геле 58
2.5.1.3. Учет результатов 59
2.5.2. Электрофорез в полиакриламидном геле 60
2.5.2.1. Приготовление 10% полиакриламидного геля 60
2.5.2.2. Проведение электрофореза в 10% полиакриламидном геле .60
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 62
3.1. Адаптация метода ПЦР для целей практической клинической диагностики хеликобактерной инфекции 62
3.1.1. Подбор оптимального приборного обеспечения амплификации...62
3.1.2. Выбор метода обработки клинического материала 65
3.1.3. Апробация экспериментальных отечественных тест-систем для ПЦР-детекции Helicobacter pylori 67
3.1.4. Антиконтаминационная защита проведения ПЦР-детекции Helicobacter pylori 74
3.1.5. Введение внутреннего контроля ПЦР 76
3.2. Выявление Helicobacter pylori в различных типах биологического материала: биоптате слизистой оболочки желудка, желудочном соке, фекалиях 79
3.3. Сопоставление результатов диагностики, полученных традиционными и молекулярно-биологическими методами 82
3.4. Выявление Helicobacter pylori у больных разных возрастных групп с различными формами гастродуоденальной патологии 87
3.5. Разработка варианта ПЦР-детекции Helicobacter pylori, позволяющего оценивать эффективность проведенной антихеликобактерной терапии 90
3.6. Исследование возможности использования метода ПЦР для выявления факторов патогенности Helicobacter pylori 95
3.7. Исследование гетерогенности нуклеотидных последовательностей фрагментов гена CagA Helicobacter pylori методом гетеро дуплексного анализа 103
Заключение 108
Выводы 118
Список литературы 119
