Введение
Глава І. Молекулярно-биологические подходы для идентификации, дифференциации и изучения генетического разнообразия природных и промышленных штаммов молочнокислых бактерий 18
1.1. Проблемы, возникающие при фенотипической идентификации молочнокислых бактерий 19
1.2. Особенности Г+Ц состава ДНК молочнокислых бактерий. Применение метода ДНК-ДНК-гибридизации для идентификации молочнокислых бактерий 25
1.3. Методы типирования ДНК 29
1.3.1. Методы, основанные на рестрикции ДНК 32
1.3.2. Применение метода геномной рестрикции для идентификации и паспортизации культур молочнокислых бактерий 34
1.3.3. Использование метода ДНК-типирования с помощью ПЦР для идентификации молочнокислых бактерий 37
1.4. Использование данных анализа последовательностей генов 16S рРНК для идентификации молочнокислых бактерий и установления их филогенетического родства 42
1.5. Сравнительная характеристика некоторых молекулярно-генетических методов типирования бактерий 48
Глава II. Частная биология молочнокислых бактерий, исследуемых в работе 51
2.1. Частная биология бактерий вида Streptococcus thermophilus 51
2.1.1. История становления современной классификации грамположительных каталазоотрицательных кокков 51
2.1.2. Фенотипическая характеристика 53
2.1.3. Генотипические особенности 55
2.2. Частная биология молочнокислых лактобацилл 58
2.2.1. Морфологические свойства 58
2.2.2. Культуральные свойства 59
2.2.3. Биохимические свойства 62
2.2.4. Систематика 67
Глава III. Практическая значимость молочнокислых бактерий и производственно-ценные свойства молочнокислых стрептококков и молочнокислых лактобацилл 67
3.1. Использование молочнокислых бактерий в пищевой промышленности в качестве заквасочных культур при производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов. Основные производственно-ценные свойства . 71
3.1.1. Кислотообразование S. thermophilus 73
3.1.2. Активность S. thermophilus по отношению к галактозе 75
3.2. Синтез экзополисахаридов штаммами молочнокислых бактерий 78
3.2.1. Структурно - функциональная характеристика экзополисахаридов молочнокислых бактерий 79
3.2.2. Биосинтез ЭПС 82
3.2.3. Использование ЭПС+ штаммов молочнокислых бактерий в качестве заквасок при производстве кисломолочных продуктов 83
Собственные исследования 88
Глава IV. Материалы и методы 88
4.1. Штаммы микроорганизмов 88
4.2. Питательные среды и условия культивирования бактерий 89
4.3. Микробиологические методы исследования 89
4.3.1. Микроскопирование 89
4.3.2. Определение ферментационной активности штаммов 89
4.3.3. Способность бактерий утилизировать сахара 89
4.3.4. Способность бактерий расщеплять эскулин 90
4.3.5. Определение спектра чувствительности к антибактериальным препаратам 90
4.3.6. Кислотообразующая активность штаммов 90 "
4.3.7. Способность штаммов синтезировать экзополисахариды 91
4.3.8. Способность бактерий ферментировать галактозу 92
4.4. Аналитические методы исследования 92
4.4.1. Количественное определение ЭПС 92
4.4.2. Определение содержания водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ 92
4.5. Генетические и молекулярно-биологические методы исследования 93
4.5.1. Выделение тотальной ДНК 93
4.5.2. Получение препаратов плазмидной ДНК 94
4.5.3. Рестрикция плазмидной и геномной ДНК 94
4.5.4. Электрофорез нативной и рестрицированной ДНК 95
4.5.5. Приготовление препаратов для проведения пульс-гель электрофореза геномной ДНК 95
4.5.6. Пульс-гель электрофорез геномной ДНК 95
4.5.7. Анализ рестриктограмм геномной ДНК, полученных методом геномной рестрикции и пульс гель электрофореза (PFGE) 96
4.5.8. Компьютерный анализ подбора праймеров 96
4.5.9. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) 97
4.5.10. Выделение и очистка ДНК 97
4.5.11. Секвенирование фрагментов генов 97
4.5.12. Филогенетический анализ последовательностей генов 16S рРНК 98
4.5.13. Проведение RAPD-PCR 98
4.5.14. Анализ рестриктограмм геномной ДНК, полученных методом RAPD-PCR, построение филогенетических деревьев и определение генетических дистанций 99
4.5.15. Генотипирование генов вирулентности 99
4.5.16. Генотипирование генов устойчивости к антибиотикам 100
4.5.17. Генотипирование генов репликации и конъюгативного переноса 103
4.5.18. Геномный анализ 103
4.6. Статистическая обработка полученных данных 104
4.7. Программное обеспечение 104
Результаты исследования и их обсуждение 106
Глава V. Применение молекулярно-биологических подходов для видовой идентификации молочнокислых бактерий 106
5.1. Сравнение данных генотипических и биохимических характеристик штаммов Streptococcus thermophilus, выделенных из кисломолочных продуктов 106
5.2. Филогенетический анализ типовых штаммов бактерий группы salivarius рода Streptococcus на основании данных о строении генов 16SpPHK 116
5.3. Идентификация подвидов Lactococcus lactis на основании данных о строении генов 16S рРНК 122
5.4. Реклассификация таксономической принадлежности отечественных пробиотических штаммов лактобацилл 129
Глава VI. Изучение генетического разнообразия бактерий рода Enterococcus, выделенных из кисломолочных продуктов 140
6.1. Видообразование у бактерий: сравнение генов 16S рРНК у близкородственных видов энтерококков 149
6.2. Генотипирование молочнокислых энтерококков на возможное присутствие генов вирулентности, свойственных патогенным энтерококкам 154
Глава VII. Изучение генетического разнаобразия и анализ размеров геномов штаммов Streptococcus thermophilus 163
Глава VIII. Изучение генетического разнообразия природных и промышленных штаммов молочнокислых бактерий 163
8.1. Изучение генетического разнообразия природных штаммов бактерий вида Streptococcus thermophilus 163
8.2. Генетическая паспортизация производственных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus 173
Глава IX. Характеристика устойчивости к антибиотикам пробиотических бактерий рода Lactobacillus 187
Глава X. Изучение технологических свойств штаммов молочнокислых бактерий 197
10.1. Технологические свойства штаммов Streptococcus thermophilus, выделенных из кисломолочных продуктов 197
10.2. Изучение технологических характеристик бактерий рода Enterococcus, выделенных из кисломолочных продуктов 208
10.3. Идентификация и отбор антагонистически активных культур Lactococcus lactis subsp. lactis 217
10.4. Разработка заквасок с низкой постокислительной активностью 219
Заключение 224
Выводы 240
Практические рекомендации 242
Список использованной литературы 243
Благодарности 286
