Введение
Глава I. Патогенные свойства возбудителей коклюша и дифтерии 18
1.1. Некоторые аспекты эволюционной изменчивости микроорганизмов 18
1.2. Биологические свойства возбудителя коклюша 26
1.2.1. Фенотипическая характеристика Bordetella pertussis 26
1.2.2. Антигенная структура и серотипирование штаммов возбудителя коклюша 27
1.2.3. Патогенные свойства штаммов В. pertussis 31
1.2.4. Генетическая характеристика штаммов В. pertussis 36
1.3. Биологические свойства возбудителя дифтерии 46
1.3.1. Микробиологическая характеристика Corynebacterium diphtheriae 46
1.3.2. Характеристика возбудителя дифтерии, циркулирующего на различных этапах эпидемического процесса дифтерийной инфекции 48
1.3.3. Патогенные свойства штаммов С. diphtheriae 55
1.3.4. Генетическая характеристика штаммов С. diphtheriae 57
Глава II. Применение молекулярно-генетических методов в диагностике коклюша и дифтерии 72
2.1. Использование молекулярно-генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний 72
Собственные исследования 84
Глава III. Материалы и методы 84
3.1 .Штаммы бактерий 84
3.2. Идентификация культур 87
3.3. Генотипирование штаммов В. pertussis 90
3.3.1. Выделение хромосомной ДНК 90
3.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) по выявлению генов: SI субъединицы коклюшного токсина (ptxA), пертактина (рт), фимбриальных генов (fim2 и/гтЗ), фактора колонизации трахеи (tc/A) 90
3.4. Генотипирование штаммов С. diphtheriae 97
3.4.1. Выделение ДНК С. diphtheriae 97
3.4.2. Амплификация фрагментов tox гена 97
3.5. Определение вирулентности штаммов В. pertussis 98
3.5.1. Заражение животных 98
3.5.2. Определение вирулентности 98
3.5.3. Лейкоцитозстимулирующая активность (ЛСА) культур 98
3.6. Статистическая обработка результатов 98
3.7. Программное обеспечение 99
Результаты исследования и их обсуждение 100
Глава IV. Структура основных генов патогенности В. pertussis и особенности циркуляции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции 100
4.1. Особенности циркуляции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции 101
4.1.1. Характеристика различных периодов эпидемического процесса коклюшной инфекции и фенотипические особенности возбудителя 101
4.2. Генетическая структура популяции штаммов В. pertussis в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции 112
4.2.1. Последовательность нуклеотидов ptxA гена, кодирующего S1 субъединицу коклюшного токсина, и распространение штаммов В. pertussis с различными аллельными вариациями (аллеломорфами) этого гена 112
4.2.2. Последовательность нуклеотидов ргп гена, кодирующего пертактин, и распространение штаммов В. pertussis с различными аллельными вариациями этого гена 117
4.2.3. Последовательность нуклеотидов фимбриальных генов (fim2 и/ЇтЗ) и распространение штаммов В. pertussis с различными их аллельными вариациями 125
4.2.4. Последовательность нуклеотидов tcfA гена, кодирующего фактор колонизации трахеи, и распространение штаммов В. pertussis с различными аллельными вариациями этого гена 131
4.2.5. Сопоставление генетической структуры штаммов В. pertussis, используемых для производства АКДС-вакцины, и штаммов, выделенных от больных коклюшем на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции 133
4.2.6. Вирулентные свойства штаммов В. pertussis, несущих новые аллельные вариации 136
Глава V. Разработка ускоренных методов, основанных на амплификационных технологиях, для наблюдения и выявления возбудителя коклюша 144
5.1. Молекулярно-генетический метод, основанный на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов, для ускоренного выявления штаммов В. pertussis, циркулирующих на современном этапе 144
5.1.1. Разработка метода слежения за генетической структурой штаммов В. pertussis 145
5.1.2. Мониторинг штаммов В. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе, методом ГШР-ПДРФ 150
5.2. Ускоренный молекулярно-генетический метод лабораторной диагностики коклюшной инфекции 152
5.2.1. Разработка ускоренного метода диагностики коклюша LAMP-вариант 153
5.2.2. Клинические испытания прямого ускоренного молекулярно-генетического метода LAMP-варианта 160
Глава VI. Особенности структуры генов, кодирующих синтез дифтерийного токсина (tox) и амилазной активности (ату) С. diphtheriae 172
6.1. Структурный ген токсинообразования (tox) С. diphtheriae 173
6.2. Особенности структуры генетической детерминанты амилазной активности штаммов С. diphtheriae 179
6.2.1. Генетическая детерминанта амилазной активности штаммов С. diphtheriae 180
6.2.2. Определение размера делеции 184
6.2.3. Способность продуцировать амилазу - дополнительный фактор патогенности С. diphtheriae 190
Глава VII. Выбор фрагмента нуклеотидной последовательности в атугеяе для определения в ПЦР принадлежности С. diphtheriae к биовару 196
7.1. Выбор специфической «мишени» и постановка ПЦР с праймерами для определения биовара С. diphtheriae 196
7.2. Апробация специфической «мишени», определяющей принадлежность к биовару, для комплексирования в мультиплексной ПЦР 200
Заключение 205
Выводы 232
Литература 235
