Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1.Использование культуры клеток и тканей растений 7
1.2. Генетические изменения, возникающие в культуре клеток и тканей растений 10
1.2.1. Изменение плоидности и числа хромосом 11
1.2.2. Хромосомные мутации 15
1.2.3. Генные мутации . 18
1.2.4. В нехромосомные изменения 19
1.3. Факторы, вызывающие генетическую нестабильность культивируемых клеток 20
1.3.1. Гетерогенность исходного материала 21
І.З.З.Условия культивирования 22
1.3.4. Влияние типа экспланта растения 24
1.3.5. Типы морфогенеза 26
1.3.6. Продолжительность культивирования 26
1.4. Механизмы сомаклональной изменчивости 28
1.5. Способы выявления сомаклональной изменчивости 34
1.5.1. Фенотипический (морфологический) уровень 35
1.5.2. Цитогенетическое изучение 37
1.5.3. Выявление полиморфизма на молекулярном уровне 40
1.5.3.1. Белковые маркеры 40
1.5.3.2.Методы анализа полиморфизма ДНК 44
1.5.3.2.1. Молекулярные маркеры на основе ПДРФ 44
1.5.3.2.2. Анализ полиморфизма генома методом полимеразной цепной реакции 45
-RAPD анализ 46
-ISSR маркеры 50
STS маркеры 51
AFLP маркеры 53
Комплексный анализ сомаклональной изменчивости 55
Гла ва 2. Материалы и методы 58
2.1. Исходный материал 58
2.2.Введение клеток в культуру in vitro и получение растений- регенерантов 60
2.3. Анализ пыльцы у растений - регенерантов. 61
2. 4. Выделение ДНК гороха для ПНР-анализа 61
2.5.Метод ПЦР-анализа с использованием RAPD- и ISSR- праймеров 63
2.6. Проведение электрофореза в агарозном геле 64
2.7. Клонирование фрагмента 65
2.7.1. Выделение фрагментов из геля 65
2.7.2.Лигирование фрагментов ДНК с pGEM-T вектором 65
2.7.3.Трансформация Е. coll (штамма JM 109) плазмидной ДНК 65
2.8.Выделение плазмидной ДНК из E.coli JM 66
2.9.Анализ плазмидной ДНК на наличие вставки 67
2.10.Секвенирование 68
2.11. Полное секвенирование длинных фрагментов 68
2.12. Математические методы обработки данных 69
2.12.1. Статистические методы 69
2.12.2. Качественная и количественная оценка полиморфизма 69
2.13. Анализ нуклеотидных последовательностей 70
Глава 3. Результаты и обсуждение 71
3.1. Получение исходного материала 71
3.2 Анализ физиологических, морфологических и количественных признаков у регенерантов гороха в потомстве Rj - R2 80
3.3. Молекулярно-генетический анализ растений - регенерантов (R0) и сомаклонов гороха 92
3.3.1. Молекулярно-генетический анализ растений - регенерантов первой группы, полученных после восьми месяцев культивирования каллусов в условиях in vitro 94
3.3.2. Молекулярно-генетический анализ растений - регенерантов второй группы, полученных после десяти лет культивирования каллусов в условиях in vitro 98
3.3.3. Количественная оценка полиморфизма ДНК у регенерантов гороха Ro с помощью молекулярных RAPD- и ISSR- маркеров 103
3.3.4. Молекулярно-генетический анализ сомаклонов гороха 107
3.4. Анализ наследования полиморфных фрагментов 113
3.5. Сиквенс полиморфных нуклеотидных последовательностей, выявляемых RAPD-и IS SR-методами 120
3.5.1. Фрагмент В340#1600 120
3.5.2.ФрагментОД5#1500 122
3.5.3. Фрагмент V#480 123
3.5.4. Фрагмент С5#550 124
3.5.5. Фрагмент ВЗШ370 125
3.5.6. Фрагмент В474Я450 126
Заключение 130
Выводы 133
Список литературы 134
Приложение 163
