Введение
1. Обзор литературы 11
1.1 Протеинкиназа А. Общие сведения 11
1.2. Доменная структура RIoc субъединицы 12
1.3. цАМФ-связывающие домены 14
1.3.1. Строение цАМФ-связывающих доменов 14
1.3.2 Модели конформационного перехода цАМФ-связывающих доменов 17
1.3.3. Лиганды цАМФ-связывающих доменов 19
1.4. Диссоциация RIoc:C комплекса при цАМФ-индуцированной активации ПКА 1а 21
1.5. Заселенность конформаций отдельных цАМФ-связывающих доменов и R-субъединицы 24
1.6. Константы, характеризующие активацию ПКА 1а 26
1.6.1. Значения констант, характеризующих активацию ПКА 1а 26
1.6.2. Обсуждение приведенных значений констант, характеризующих активацию ПКА 1а 30
1.6.2.1. Константы диссоциации RC комплекса на свободные R- и С-субъединицы 30
1.6.2.2. Константы диссоциации цАМФ из цАМФ-связывающих сайтов R-субъединицы 32
1.6.2.3. Константы активации RC комплекса 34
1.7. Связь настоящего исследования с литературными данными 34
2. Методы 36
2.1. Докинг лигандов в цАМФ-связывающие сайты А- и В-домена RIa 36
2.2. Квантово-химический анализ параметров водородных связей, образуемых экваториальным атомом кислорода (серы) лиганда и амидной группой белка 36
2.3. Изучение конформационных переходов (3-субдомена А-домена RIa, равновесия между его конформациями и влияния на это равновесие мутационных замен R209 37
2.3.1. Подготовка (3-субдомена 38
2.3.2. Моделирование конформационного равновесия (3-субдомена 38
2.3.3. Математическая обработка результатов методом кластерного анализа 40
2.4. Изучение Н— В конформационного перехода А-домена ПКА la 42
2.4.1. Подготовка А-домена 42
2.4.2. Моделирование Н— В конформационного перехода А-домена ПКА la методами молекулярной динамики з
2.4.2.1 Методика моделирования Н— В конформационного перехода А-домена RIa 43
2.4.2.2. Метод ускоренной молекулярной динамики (уМД) 44
2.4.3. Математическая обработка результатов методами факторного и кросскорреляционного
анализов 47
2.5. Дополнительные программы и методики, применяемые при постановке моделирований и
анализе их результатов 50
2.5.1. Выравнивание пространственных структур цАМФ-связывающих доменов и расчет RMSD между ними 50
2.5.2. Измерение углов между спиралями 51
2.5.3. Визуализация третичных структур 51
3. Анализ взаимодействия лигандов со связывающими сайтами а- и в доменовпка 52
3.1 Докинг цАМФ в цАМФ-связывающие сайты А- и В-доменов ПКА 52
3.2. Докинг Sp-nAMOS в цАМФ-связывающий сайт В-домена ПКА 54
3.3. Докинг Rp-цAMOS в цАМФ-связывающий сайт В-домена ПКА la 55
3.4. Квантово-химический анализ параметров водородных связей, образуемых
экваториальным атомом кислорода (серы) лиганда и амидной группой белка 56
3.5 Обсуждение результатов 57
3.5.1. цАМФ-связывающий сайт А-домена R-субъединицы, находящейся в составе RC комплекса, может связывать цАМФ 57
3.5.2. Rp-цAMФS и Зр-цАМФБ могут образовывать стабильные комплексы как со свободной R-субъединицей, так и с R-субъединицей, входящей в состав RC комплекса 58
3.5.3. Смещение амидной группы А202(А326) может запускать конформационный переход цАМФ-связывающих доменов 59
3.5.4 Численная оценка значений констант, характеризующих процесс активации ПКА la 59
3.6. Промежуточные выводы 62
4. Механизм взаимодействия лигандов с цамф-связывающим сайтом цамф-связывающих доменов ПКА la 63
4.1. Взаимодействие цАМФ с цАМФ-связывающим сайтом А-домена ПКА la 63
4.2. Взаимодействие Rp-uAMPS с цАМР-связывающим сайтом В-домена ПКА la 66
4.3. Обсуждение результатов 68
4.3.1. Переход А-домена ПКА la в В-конформацию запускается смещением амидной группы А202 68
4.3.2. Экспериментальные подтверждения предложенной модели обратного агонизма Rp-цАМФБ 70 4.4. Промежуточные выводы 72
5. Аминокислотный остаток в положении 209 как фактор стабилизации в-конформации а-домена ПКА 1а 73
5.1. Описание конформаций, принимаемых (3-субдоменом А-домена ПКА 1а 73
5.2. Заселенность конформаций Р-субдомена А-доменаПКА 1а 75
5.2.1. Р-субдомен белка дикого типа в комплексе с цАМФ и не связанный с лигандом 75
5.2.2 Р-субдомен с точечной заменой R209I в комплексе с цАМФ 79
5.2.3. Р-субдомен с точечной заменой R209E, не связанный с лигандом 80
5.2.4. Р-субдомен с точечной заменой R209G, не связанный с лигандом 81
5.2.5. Р-субдомен с точечной заменой R209K, не связанный с лигандом 82
5.2.6. Р-субдомен с точечной заменой R209K в комплексе с цАМФ 83
5.3. Обсуждение результатов 87
5.3.1. Вопрос применимости данных, полученных на Р-субдомене к целому цАМФ-связывающему домену 87
5.3.2. Роль аминокислотного остатка в положении 209 в функционировании цАМФ-связывающего А-доменаПКА 1а 89
5.3.3. Электростатический «переключатель» R209-D170-R226 как механизм стабилизации конечных конформаций А-домена ПКА la, а не реализации конформационного перехода между ними 93
5.4. Промежуточные выводы 95
6. Характеристика механизма перехода а-домена r-субъединицы пка 1а из н- в в-конформацию. роль гидрофобного и электростатического «переключателей» в изменении конформаций цамф-связывающих доменов 97
6.1. Оценка результатов моделирования Н— В конформационного перехода для А-доменов дикого типа и с мутационной заменой R209K 98
6.2. Общая характеристика стадий и событий перехода А-домена из Н- в В-конформацию 99
6.3. Описание событий конформационного перехода А-домена из Н- в В-конформацию 103
6.3.1. События, в основе которых лежит конформационное изменение ФСК 103
6.3.2. События, в основе которых лежит конформационное изменение N3А-мотива 105
6.3.3. События, в основе которых лежит конформационное изменение В/С-спирали 106
6.4. Описание первого приближения к пути минимальной свободной энергии (ПМСЭ) перехода А-домена из Н- в В-конформацию 111
6.5. Обсуждение результатов 113
6.5.1 Связь изложенных результатов с существующими экспериментальными и расчетными данными 113
6.5.2. Применимость полученных результатов к другим цАМФ-связывающим доменам 116
6.6. Промежуточные выводы 124
Заключение 126
Выводы 130
Список сокращений 131
Список литературы
