Введение
ГЛАВА 1. Молекулярные основы взаимодействий, обеспечивающих инициацию трансляции РНК вируса гепатита С (Обзор литературы) 9
1.1. Структура IRES 11
1.1.1. Структура домена II 13
1.1.2. Структура домена III 17
1.1.3. Структура соединения ШаЬс 22
1.2. Стадии IRES-зависимой инициации трансляции РНК ВГС и факторы необходимые для этого процесса 24
1.2.1. Образование бинарного комплекса 24
1.2.2. Образование 48S инициаторного комплекса 26
1.2.3. Образование 80S инициаторного комплекса 27
1.3. Альтернативный способ IRES зависимой инициации трансляции у ВГС 29
1.4. Функциональная роль доменов IRES ВГС в инициации трансляции 32
1.4.1. Функциональная роль домена III 32
1.4.1.1. Влияние мутаций в IRES ВГС на эффективность инициации трансляции...32
1.4.1.2. Участие домена III в связывании IRES ВГС с 40S субчастицей 35
1.4.1.3. Участие домена III IRES ВГС в его связывании с eIF3 39
1.4.1.4. Участие домена III IRES в формировании 48S и 80S комплексов инициаци. 40
1.4.2. Функциональная роль домена II 40
1.4.2.1. Участие домена II в высвобождении фактора eIF2 42
1.4.2.2. Влияние структуры домена II на функционирование IRES ВГС 43
1.4.2.3. Взаимосвязь домена II ирибосомного белка S5 44
1.4.3. Функциональная роль других районов 45
1.5. Структура комплексов инициации IRES ВГС по данным крио-ЭМ и сшивок 47
1.5.1. Взаимодействие IRES с 40S субчастицей рибосомы 47
1.5.2. Комплекс IRES ВГС с фактором инициации eIF3 50
1.5.3. Структурная модель IRES»40S«eIF3 комплекса 52
1.5.4. SOS-инициаторный комплекс 53
1.5.4.1. Конформагщонные перестройки 40S субчастиц, вызванные связыванием IRES ВГС с 80S рибосомой 53
1.5.4.2. Структура IRES ВГС в 805-комплексе 55
1.5.4.3. Контакты IRES ВГС в SOS-комплексе 58
1.6. Дополнительные факторы, влияющие на эффективность трансляции мРНК вируса гепатита С 60
1.7. Заключение 65
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 67
2.1. Материалы 67
2.2. Выделение рибосомных 40S субчастиц из плаценты человека 68
2.3. Наработка и выделение плазмиды pXL40-372.NS 70
2.4. Получение IRES ВГС с помощью Т7-транскрипции 70
2.4.1. Получение статистически [32Р]-меченого IRES ВГС 70
2.4.2. Получение биотинилированого слабомеченого IRES ВГС 71
2.5. Фосфорилирование олигонуклеотидов по 5-концу 71
2.6. Получение 4-[г>[-(2-хлорэтил)-К-метиламино]бензил-5-фосфамидов ол игодезоксирибонуклеотидов 72
2.7. Сайт-направленное введение фотоактивируемой группы в IRES ВГС 73
2.7.1. Комплементарно-адресованная модификация IRES ВГС 73
2.7.2. Гидролиз фосфамидной связи 73
2.7.3. Введение перфторфенилазидогруппы 74
2.8. Гидролиз ковалентных аддуктов IRES ВГС с помощью РНКазы Н 74
2.9. Определение модифицированных нуклеотидов в IRES ВГС с помощью метода обратной транскрипции 74
2.10. Получение бинарных комплексов 40S рибосомных субчастиц с IRES ВГС и его фотоактивируемыми производными 75
2.11. Определение степени связывания IRES ВГС и его производных с 40S субчастицами 76
2.12. Фотоаффинная модификация 40S субчастиц производными IRES ВГС 77
2.13. Выделение бинарных комплексов 40S субчастиц с IRES ВГС и его фотактивируемыми производными с помощью сахарозного градиента 77
2.14. Разделение модифицированных субчастиц на РНК и белки с помощью сахарозного градиента 77
2.15. Выделение суммарной РНК из модифицированных субчастиц 78
2.16. Анализ модификации 18S рРНК электрофорезом в агарозе 79
2.17. Выделение рибосомных белков из комплексов 40S субчастиц с производными IRES ВГС 79
2.18. Выделение рибосомных белков, сшитых с производными биотинилированного IRES ВГС 80
2.19. Выделение суммарного белка 40S субчастицы экстракцией уксусной кислотой 80
2.20. Определение модифицированных рибосомных белков с помощью одномерного гель-электрофореза 81
2.21. Определение модифицированных рибосомных белков с помощью двумерного гель-электрофореза 82
2.22. Анализ модифицированных белков с помощью иммунопреципитации 83
ГЛАВА 3. Молекулярное окружение IRES-элемента РНК вируса гепатита С на 40S субчастице рибосомы человека 84
3.1. Исследование роли различных доменов IRES ВГС в связывании с 40S субчастицей 84
3.1.1. Критерии выбора олигодезоксирибонуклеотидов для комплементарно-адресованной модификации 85
3.1.2. Получение ковалентных аддуктов 32Р-меченого IRES ВГС с производными олигодезоксирибонуклеотидов 85
3.1.3. Анализ связывания аддуктов IRES ВГС с 40S рибосомными субчастицами 90
3.2. Получение и характеризация производных IRES ВГС 92
3.2.1. Введение фотактивируемых групп в определенные положения IRES ВГС 92
3.2.2. Определение модифицированных нуклеотидов IRES ВГС 95
3.2.3. Связывание фотоактивируемых производных IRES ВГС с 40S субчастицами 97
3.3. Определение компонентов 40S субчастицы, сшивающихся с производными IRES ВГС 98
3.3.1. Сшивка производных IRES ВГС с 40S субчастицей и анализ модификации 18SpPHK 98
3.3.2. Определение белков, сшитых с производными IRES ВГС в бинарном комплексе 99
3.3.2.1. Особенности идентификации сшитых белков 99
3.3.2.2. Определение белков 40S субчастицы, сшитых с РНК IV и VII 100
3.3.2.3. Определение белков, сшитых с РНК III, V и VIII 104
3.4. Рибосомные компоненты, окружающие IRES ВГС Ha40S субчастице 107
3.5. Соотнесение полученных данных с данными крио-электронной микроскопии 110
Заключение 113
Выводы 114
Список литературы 115
