Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Роль ферментной системы цитохрома Р450 13
1.2 Открытие разнообразия фементных систем цитохрома Р450 14
1.3 Микросомальная ферментная система цитохрома Р450 1.3.1 Общая характеристика микросомальной монооксигеназной Р450-зависимой системы 16
1.3.2 Структура и свойства цитохром Р450 редуктазы 18
1.3.3 Роль межмолекулярных взаимодействий CYP-CPR в функционировании микросомальной монооксигеназной системы 25
1.3.4 Структура и функции микросомального цитохрома Ь5 26
1.3.5 Митохондриальная изоформа цитохрома Ь5 36
1.3.6 Значение межмолекулярных взаимодействий между CYP и CYB5 37
1.4 Митохондриальная ферментая система цитохрома Р450 38
1.4.1 Характеристика митохондриальной монооксигеназной системы 38
1.4.2 Структураи функция адренодоксина 41
1.4.3 Взаимодействие адренодоксина с микросомальными Р450 51
1.5 Бактериальная ферментная система цитохрома Р450 53
1.5.1 История изучения бактериальных цитохромов Р450 53
1.5.2 Функции бактериальных цитохромов Р450 1.6 Эволюция и разнообразие ферментных систем цитохрома Р450 55
1.7 Метод SPR (Surface Plasmon Resonance) 1.7.1 Описание подходов для изучения белок-белковых комплексов 59
1.7.2 Описание явления SPR 60
1.7.3 Описание принципа детекции межмолекулярных взаимодействий оптическими биосенсорами на эффекте SPR 62
Глава 2. Материалы и методы 67
2.1 Оборудование 67
2.2 Материалы 67
2.3 Регистрация белок-белковых взаимодействий с помощью оптического биосенсора на технологии оптического плазмонного резонанса з
2.3.1 Подготовка прибора 72
2.3.2 Подготовка буфера 72
2.3.3 Подбор иммобилизационного буфера 72
2.3.4 Иммобилизация лигандов на чипе СМ-5 73
2.3.5 Подготовка аналита 77
2.3.6 Анализ взаимодействий 78
2.3.7 Обработка данных и анализ кинетики 2.4 Анализ термодинамических параметров взаимодействия цитохромов Р450 и иммобилизированных белков-партнёров 79
2.5 Методы статистической обработки 2.5.1 Определение доверительного интервала для получаемых параметров взаимодействия 80
2.5.2 Фитинг 81
2.5.3 Алгоритм Левенберга-Марквардта 81
2.5.4 Оценка качества фитирования 81
2.5.5 Достоверность данных 82
Глава 3. Результаты и их обсуждение 83
3.1 Подбор иммобилизационного буфера 83
3.2 Подбор экспериментальных условий и анализ взаимодействий 83
3.3 Аффинность и селективность взаимодействия CYP с CYB5 (А и В) крысы и человека 106
3.4 Определение термодинамических параметров образования белок-белковых комплексов CYPc CYB5 (АиВ) крысы и человека 109
3.5 Аффинность и селективность взаимодействия CYP с CPR крысы и AdX человека 119
3.6 Определение термодинамических параметров белок-белковых комплексов CYP с CPR крысы и AdX человека 120
Заключение 131
Выводы 136
Благодарности 137
Список литературы
