Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Основные морфологические элементы рибосомы 11
2.2. Инициация трансляции 15
2.3. Связывание аа-тРНК с Аучастком 33
2.4. Пептидилтрансферазная реакция 55
2.5. Транслокация 74
3. Результаты и их обсуждение 104
3.1. Мутагенез рРНК и способы выделения рибосом, содержащих мутации..105
3.1.1. Используемые плазмиды 105
3.1.2. Используемые штаммы 107
3.1.3. Выделение рибосом, несущих летальные мутации 108
3.2. Определение генов, кодирующих рРНК метилтрансферазы и получение рибосом, не содержащих метилированных оснований 114
3.3. Методы изучения фенотипа мутаций и отсутствия модификаций рРНК 118
3.3.1. Измерение характеристик роста клеток 118
3.3.2. Измерение точности трансляции in vivo 119
3.3.3. Химическая модификация 120
3.3.4. Выделение компонентов для тестов in vitro 121
3.3.5. Toy-принт 123
3.3.6. Изучение связывания тРНК с рибосомой 124
3.3.7. Измерение активности белковых факторов трансляции 126
3.4. Определение гена рРНК-метилтрансферазы, метилирующей G966 16S рРНК 128
3.5. Мутации нуклеотидов спиралей 31,34,35 и 38 16S рРНК. 133
3.6. Определение гена рРНК-метилтрансферазы, метилирующей G1835 23S рРНК 142
3.7. Изучение функциональной значимости межсубчастичного мостика В1а: укорочение ASF 146
3.8. Мутации нуклеотидов, образующих "ворота", через которые проходит перемещение аа-тРНК в А участок 152
3.9 Разработка метода прямого определения протонированных оснований в рРНК 158
3.10. Определение гена рРНК-метилтрансферазы, метилирующей G2445 23S рРНК 162
3.11. Определение гена рРНК-метилтрансферазы, метилирующей А1618 23S рРНК 166
3.12. Изучение роли Е участка в работе рибосомы с помощью мутации C2394G, препятствующей связыванию тРНК с Р и Р/Е участками 173
3.13. Изучение роли нуклеотида G2655 SRL 23S рРНК в связывании EF-G и транслокации 188
3.14. Изучение роли взаимодействия между спиралями 89 и 91 23S рРНК в функционировании факторов трансляции - GTPa3 192
3.15. Изучение роли взаимодеііствия между спиралями 39 23S рРНК и D петлей 5S рРНК в формировании структуры РТС и участка предполагаемой передачи аллостерического сигнала 203
3.16. Изучение движения GAC, как основного конформационного изменения, необходимого для связывания EF-G. Роль GAC в связывании EF-G и EF-Ти 208
4. Материалы и методы 223
4.1 Реактивы и биопрепараты 223
4.2. Буферы и растворы 223
4.3. Штаммы и плазмиды 227
4.4 Манипуляции с ДНК: клонирование, мутагенез 232
4.4.1 Выделение плазмидной ДНК 232
4.4.2. Определение концентрации ДНК в растворе 232
4.4.3 ПЦР 232
4.4.4. Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле 233
4.4.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 233
4.4.6. Приготовление векторов и вставок 234
4.4.7. Лигирование 234
4.4.8. Приготовление компетентных клеток Е. coli 234
4.4.9. Трансформация компетентных клеток Е. coli 235
4.4.10. Мутагенез М13 по методу Кункеля 235
4.4.11. Мутагенез с помощью набора QuickChange (Stratagene) 236
4.4.12. Создание плазмид для экспрессии генов 16S и 23S рРНК с мутациями 236
4.4.13. Создание плазмиды, кодирующей модельную мРНК 237
4.4.14. Создание плазмиды pYbinPPAA 237
4.5. Манипуляции с клетками 238
4.5.1. Создание штаммов для экспрессии генов рРНК с мутациями...238
4.5.2 Измерение времени удвоения клеток 238
4.5.3. Измерение скорости вытеснения клеток мутантных штаммов клетками дикого типа при совместном культивировании 239
4.5.4. Измерение точности трансляции in vivo 239
4.5.5. Создание штаммов для экспрессии генов рекомбинантных белков 240
4.6 Выделение рибосом, рибосомных субчастиц, рРНК и частично депротеинизированных частиц 240
4.6.1. Выделение рибосом из штамма AVS69009 240
4.6.2. Выделение рибосом с помощью аффинной хроматографии 241
4.6.3. Выделение больших количеств рибосом 242
4.6.4. Выделение рРНК 244
4.6.5. Выделение суммарной клеточной РНК 244
4.6.6. Выделение частиц, частично депротеинизированных LiCl 244
4.6.7. Выделение частиц, частично депротеинизированных NH4Cl/EtOH 244
4.7. Выделение рекомбинантных белков 245
4.7.1. Выделение рекомбинантных белков с помощью аффинной хроматографии на NiNTA агарозе 245
4.7.2. Электрофоретическое разделение белков в SDS-ПААГ 246
4.8 Выделение других компонентов для реакций in vitro 246
4.8.1. Получение S100 экстракта без тРНК 246
4.8.2. Получение аминоацил-тРНК 247
4.8.2.1. Получение [3H]Met-TPHKfMet Е. coli 247
4.8.2.2. Получение [14C]Phe-TPHKPhe Е. coli 248
4.8.2.3. Получение Lys-TPHKLys . coli 249
4.8.2.4. Получение радиоактивно меченной тРИК^-Е. coli 249
4.8.2.5. Получение радиоактивно меченной TPHKf,et Е. coli 249
4.8.3. Получение мРНК, кодирующей MFK пептид 250
4.8.4. Электрофорез РНК в денатурирующем ПААГ 250
4.9. Манипуляции с рРНК в составе рибосом и в депротеинизированном виде ..251
4.9.1. Ферментативное метилирование рибосом, рРНК и частично депротеинизированных частиц 251
4.9.2. Обработка рибосом и рРНК борогидридом натрия для модификации протонированных оснований 251
4.9.3. Обработка рибосом и рРНК модифицирующими реагентами...252
4.9.3.1. Модификация диметилсульфатом 252
4.9.3.2. Модификация кетоксалем 252
4.9.3.3. Модификация карбодиимидом 252
4.9.4. Вырезание фрагмента РНК с помощью РНКазы Н 252
4.9.5. Разрезание фрагмента РНК с помощью РНКазы ТІ 253
4.9.6. Анализ олигонуклеотидных фрагментов рРНК с помощью масс-спектрометрии 253
4.9.7. Анализ модификации рРНК с помощью обратной.транскрипции 253
4.9.8. Анализ с помощью обратной транскрипции соотношения рРНК дикого типа и рРНК, несущей мутации в образце 254
4.10 Функциональные тесты рибосом 254
4.10.1. Оценка способности рибосомных субчастиц к ассоциации 254
4.10.2. Оценка эффективности poIyU-зависимого синтеза polyPhe и частоты ошибочного встраивания Leu 255
4.10.3. Тестирование при помощи тоу-принта способности мутантных рибосом осуществлять базовые стадии процесса трансляции in vitro ...255
4.10.4. Стимуляция СТРазной активности фактора элонгации G 256
4.10.5. Стимуляция СТРазной активности фактора инициации 2 257
4.10.6. Стимуляция СТРазной активности фактора элонгации Ти 257
4.10.7. Анализ функциональных комплексов рибосомы с помощью химической модификации (футпринтинг) 257
4.10.8. Определение степени связывания тРНК с рибосомами с помощью фильтрования через нитроцеллюлозные фильтры 258
4.10.9. Измерение степени и скорости образования дипептида .259
4.10.10. Пуромициновая реакция 261
5. Выводы 262
6. Список цитируемой литературы 263
7. Список публикаций по теме диссертации 283
