Введение
1. Литературный обзор 16
1.1. Введение в литературный обзор 16
1.2. Ихтиотоксичность и общая токсичность 18
1.3. Мутагенная активность 19
1.4. Гемолитическая активность 19
1.5. Противогрибковая активность 21
1.6. Антипротозойная активность 23
1.7. Нейротоксические свойства 24
1.8. Взаимодействие с биологическими мембранами 25
1.9. Взаимодействие с рецепторами . 32
1.10. Иммуномодулирующая активность 33
1.11. Противоопухолевая активность тритерпеновых гликозидов 39
1.12. Биомедицинские препараты, БАДы и другие продукты функционального питания на основе гликозидов голотурий 48
1.13. Фармакокинетика тритерпеновых гликозидов 58
1.14. P2X рецепторы 60
2. Материалы и методы 77
2.1. Исследуемые соединения 77
2.2. Животные 80
2.3. Получение и культивирование клеток 81
2.4. Определение жизнеспособности клеток. 82
2.5. Определение острой токсичности . 85
2.6. Определение иммуномодулирующей активности 85
2.6.1. Распластывание, адгезия и подвижность 85
2.6.2. Определение лизосомальной активности 87
2.6.3. Определение АФК, NO и iNOs 88
2.7. Исследование специфической активности кумазида 89
2.7.1. Влияние на устойчивость к инфекции мышей 89
2.7.2. Исследование радиозащитного действия 90
2.7.3. Исследование влияния профилактического введения кумазида на кроветворение сублетально облученных мышей . 90
2.7.4. Оценка люминолзависимой и люцигенинзависимой хемилюминесценции (ХЛ) нейтрофилов человека . 91
2.7.5. Определение поглотительной активности фагоцитов периферической крови человека 91
2.7.6. Определение бактерицидной активности (киллинга) лейкоцитов периферической крови человека 92
2.7.7. Определение накопления антителообразующих клеток (АОК) у мышей . 93
2.7.8. Определение реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у мышей 93
2.7.9. Определение пролиферативной активности лимфоцитов человека 94
2.7.10. Определение продукции цитокинов мононуклеарными клетками человека 94
2.7.11. Исследование экспрессии мембраноассоциированных структур лимфоцитов 94
2.8. Исследование фармакодинамики кумазида 95
2.8.1. Связывание 3Н-кукумариозида А2-2 с перитонеальными макрофагами мыши . 95
2.8.2. Измерение микровязкости мембран клеток 96
2.8.3. Измерение мембранного потенциала клеток 96
2.8.4. Микроцитофлуориметрическая оценка транспорта Са2+ в клетках 97
2.8.5. Иммуноцитохимическое исследование перитонеальных макрофагов 99
2.8.6. Регистрация трансмембранных токов в клетках методом пэтч-кламп 99
2.8.7. Протеомный анализ 100
2.8.8. Поверхностный плазмонный резонанс 104
2.8.9. Транзиентная трансфекция клеток малыми интерферирующими РНК (siRNA) . 105
2.8.10. Экспрессия Р2Х4 рецепторов. Иммуноблотинг 106
2.9. Исследование безопасности кумазида 107
2.9.1. Оценка острой токсичности 107
2.9.2. Оценка кумулятивной токсичности 107
2.9.3. Оценка хронической токсичности 107
2.9.4. Оценка репродуктивной токсичности 108
2.9.5. Оценка мутагенной активности . 110
2.10. Построение модели пространственной структуры mP2X4 рецептора мыши и кукумариозида А2-2 112
2.11. Исследование фармакокинетики кукумариозида А2-2 113
2.11.1. Исследование фармакокинетики 3Н-кукумариозида A2-2 113
2.11.2. MALDI-IMS 114
2.11.3. MALDI-TOF MS 115
2.12. Исследование противоопухолевой активности in vivo 116
2.13 Двугибридная дрожжевая тест-система для оценки эстрогенной активности химических соединений . 118
2.14. Статистический анализ 120
3. Результаты и обсуждение 121
3.1. Исследование цитотоксического действия тритерпеновых гликозидов голотурий 121
3.1.1. Цитотоксическая активность тритерпеновых гликозидов в отношении эмбрионов морского ежа 121
3.1.2. Влияние тритерпеновых гликозидов на жизнеспособность опухолевых клеток . 123
3.1.3. Цитотоксическая активность тритерпеновых гликозидов в отношении иммунокомпетентных клеток 128
3.1.4. Гемолитическая активность кукумариозида А2-2 и фрондозида А 128
3.1.5. Оценка острой токсичности 129
3.2. Исследование иммуномодулирующей активности тритерпеновых гликозидов 130
3.2.1. Адгезия, распластывание и подвижность макрофагов 130
3.2.2. Влияние тритерпеновых гликозидов на лизосомальную активность и уровень АФК и NO в макрофагах мыши . 137
3.2.3. Влияние тритерпеновых гликозидов на формирование NO и активность iNO синтазы в макрофагах мыши in vitro . 148
3.3. Иммуномодулирующая активность препарата кумазид 151
3.3.1. Создание препарата кумазид 151
3.3.2. Изучение гемолитической и цитотоксической (эмбриотоксической) активностей кумазида . 153
3.3.3. Исследование влияния кумазида на лизосомальную активность макрофагов . 155
3.4. Изучение безопасности препарата кумазид 157
3.4.1. Острая токсичность кумазида 157
3.4.2. Кумулятивные свойства кумазида 158
3.4.3. Хроническая токсичность кумазида 158
3.4.4. Патоморфологические исследования органов крыс, получавших кумазид 159
3.4.5. Оценка репродуктивной токсичности препарата кумазид 160
3.4.6. Оценка мутагенной активности препарата кумазид 160
3.5. Исследование специфической иммунологической активности препарата кумазид 162
3.5.1. Влияние кумазида на люминолзависимую и люцигенинзависимую хемилюминесценцию нейтрофилов человека 162
3.5.2. Влияние кумазида на поглотительную активность фагоцитов периферической крови человека 165
3.5.3. Влияние кумазида на бактерицидную активность лейкоцитов периферической крови человека 168
3.5.4. Влияние кумазида на пролиферативную активность лимфоцитов человека 169
3.5.5. Влияние кумазида на продукцию цитокинов мононуклеарными клетками человека 170
3.5.6. Влияние кумазида на экспрессию мембраноассоциированных структур лимфоцитов 172
3.5.7. Влияние кумазида на экспрессию активационных антигенов лимфоцитов периферической крови здоровых доноров 174
3.5.8. Влияние кумазида на накопление антителообразующих клеток у мышей.. 175
3.5.9. Влияние кумазида на реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей 176
3.5.10. Влияние кумазида на антиифекционную резистентность мышей 177
3.5.11. Исследование радиозащитного действия кумазида 180
3.6. Противоопухолевая активность in vivo 186
3.6.1. Изучение превентивной противоопухолевой активности кукумариозида А2-2 и фрондозида А 186
3.6.2. Противоопухолевая активность кумазида 187
3.7. Фармакокинетические исследования кумазида 194
3.7.1. Исследование фармакокинетики 3Н-кумазида 194
3.7.2. Исследование фармакокинетики кукумариозида А2-2 в гомогенате селезенки мышей методом радиоспектроскопии 198
3.7.3. Идентификация и количественное определение кукумариозида А2-2 в гомогенате селезенки мыши методом MALDI-TOF MS 199
3.7.4. Исследование стабильности кукумариозида A2-2 в тканях селезенки 201
3.7.5. Оценка пространственного распределения кукумариозида А2-2 методом MALDI-IMS 202
3.8. Исследование фармакодинамики 205
3.8.1. Протеомный анализ белков с помощью двумерного гель-электрофореза и масс-спектрометрии 205
3.8.2. Исследование эстрогенной активности тритерпеновых гликозидов 224
3.8.3. Взаимодействие кукумариозида А2-2 с мембранами иммунокомпетентных клеток 230
3.8.4. Влияние кукумариозида А2-2 на микровязкость биомембран 232
3.8.5. Влияние кукумариозида А2-2 на мембранный потенциал перитонеальных макрофагов мыши 234
3.8.6. Влияние кукумариозида А2-2 на транспорт Са2+ в перитонеальных макрофагах мышей 236
3.8.7. Влияние кукумариозида А2-2 на функционирование пуриновых рецепторов в макрофагах 242
3.8.8. Электрофизиологическое исследование ионных токов в одиночных макрофагах 250
3.8.9. Типирование популяции перитонеальных макрофагов мыши, принимающих участие в Са2+ ответе на кукумариозид А2-2 . 255
3.8.10. Компьютерное моделирование пространственной структуры комплекса кукумариозида А2-2 с пуриновым рецептором Р2Х4 260
Заключение 268
Выводы 273
Список используемых сокращений 275
Список литературы 276
