Введение
1. Литературный обзор 11
1.1. Тритерпеновые гликозиды 11
1.1.1. Химическое строение тритерпеновых гликозидов голотурий 11
1.1.2. Распространение тритерпеновых гликозидов в природе 12
1.1.3. Биологическая активность тритерпеновых гликозидов голотурий 12
1.1.3.1. Цитотоксические свойства и противоопухолевая активность тритерпеновых гликозидов 16
1.1.3.2. Влияние на множественную лекарственную устойчивость 24
1.1.3.3. Взаимодействие тритерпеновых гликозидов с биомембранами 26
2. Материалы и методы 32
2.1. Исследуемые соединения 32
2.2. Лабораторные животные 32
2.3. Получение клеток 33
2.3.1. Получение клеток асцитной карциномы Эрлиха 33
2.3.2. Культивирование опухолевых клеток человека 33
2.4. Определение жизнеспособности клеток 33
2.4.1. Определение цитотоксической активности (окрашивание трипановым синим) 33
2.4.2. Измерение активности неспецифической эстеразы 34
2.4.3. Определение цитотоксической активности (МТТ тест) 34
2.5. Определение индукции апоптоза 35
2.5.1. Изучение инверсии фосфатидилсерина 35
2.5.2. Исследование индукции апоптоза в клетках асцитной карциномы Эрлиха с помощью
флуоресцентных зондов PI и Hoechst 33342 35
2.5.3 Определение каспазы-3 и -9, PARP-1 36
2.5.4. Исследование клеточной деструкции методом фазово-контрастной и электронной микроскопии 38
2.5.5. Исследование влияния на активность белка р53 38
2.6. Исследование клеточного цикла 39
2.6.1. Определение фаз клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии 39
2.6.2. Определение включения Н-тимидина в ДНК опухолевых клеток 41
2.7. Исследование колониеобразования опухолевых клеток 41
2.8. Определение множественной устойчивости з
2.8.1. Исследование блокирования множественной лекарственной устойчивости с помощью флуоресцентного зонда Calcein AM 42
2.8.2. Изучение динамики накопления доксорубицина в клетках асцитной карциномы Эрлиха 42
2.8.3. Исследование выброса доксорубицина из опухолевых клеток 42
2.9. Протеомный анализ РСЗ клеток (2D-PAGE) 43
2.10. Верификация белков (2Б-вестерн-блоттинг) 44
2.11. Функциональный анализ белков методами биоинформатики 45
2.12. Исследование противоопухолевой активности кукумариозида Аг-2
в экспериментах in vivo 45
2.13. Влияние кукумариозида Аг-2 на противоопухолевую активность доксорубицина в экспериментах in vivo 46
2.14. Статистический анализ 47
3. Результаты и обсуждение 48
3.1. Цитотоксическая активность тритерпеновых гликозидов 48
3.1.1. Определение жизнеспособности с помощью красителя трипановый синий 48
3.1.2. Определение активности неспецифической эстеразы 49
3.1.3. Определение жизнеспособности опухолевых клеток с помощью метода МТТ 50
3.2. Изучение индукции апоптоза 52
3.2.1. Изучение инверсии фосфатидилсерина 52
3.2.2. Исследование конденсации хроматина 55
3.2.3. Исследование активности казпазы-3, -9 HPARP-І 57
3.2.4. Исследование клеточной деструкции методом фазово-контрастной и электронной микроскопии 61
3.2.5. Влияние на активность белка р53 63
3.3. Исследование клеточного цикла 64
3.3.1. Определение фаз клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии 64
3.3.2. Определение включения Н-тимидина в ДНК клеток 69
3.4 Влияние тритерпеновых гликозидов на колониеобразование опухолевых клеток 70
3.5. Исследование влияния кукумариозида Аг-2 и фрондозида А на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток 73
3.5.1. Изучение множественной лекарственной устойчивости с помощью флуоресцентного зонда Calcein AM 73
3.5.2. Изучение транспорта доксорубицина в опухолевых клетках 75
3.6. Исследование влияния тритерпеновых гликозидов на протеом опухолевых клеток человека 77
3.6.1. Протеомный анализ белков с помощью 2D-PAGE и MALDI-MS 77
3.6.2. Биоинформационный анализ 96
3.6.3. Верификация экспрессии белков методом вестерн-блоттинг и 2В-вестерн блоттинг 98
3.7. Исследование противоопухолевой активности кукумариозида Аг-2 in vivo 102
3.8. Влияние кукумариозида Аг-2 на противоопухолевую активность доксорубицина in vivo 104
Заключение 107
Выводы по
Список используемых сокращений 112
Список литературы
