Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Основные типы биологических ритмов и систем их контроля.. 10
1.1.1. Осциллятор и наблюдаемые ритмы 13
1.1.2. Кривая подстройки фазы: почему она важна? 18
1.1.3 .Генетический анализ циркадианного осциллятора 20
1.1.4. Околоприливный осциллятор 25
1.2. Основные черты экологии и биологии размножения береговых крабов рода Sesarma 26
1.2.1. Репродуктивная система береговых крабов 27
1.2.2. Синхронизация нереста крабов с циклами внешней среды 30
1.2.3. Синхронизация хатчинга эмбрионов 33
1.3. Нерестовые протеиназы: структура и биологические функции 38
1.4. Белки теплового шока и их роль в эмбриогенезе 41
2. Материалы и методы исследования 45
2.1. Животные и микроорганизмы для экспериментов 45
2.2. Реактивы и среды 47
2.3. Очистка протеиназы хроматографическими методами 50
2.4. Электрофорез белков 51
2.5. Получение библиотек кДНК, обогащенных последовательностями специфически экспрессирующихся в программе нереста крабов 51
2.6. Скрининг библиотеки кДНК и клонирование гена, кодирующего OHSS 57
2.7. Статистическая обработка данных 60
3. Результаты исследований 61
3.1 Выделение и очистка нерестовой протеиназы 61
3.1.1. Биологическая активность OHSS 61
3.1.2. Очистка и выделение нерестовой протеиназы методами хроматографии 63
3.1.3. Устойчивость биологической активности OHSS 64
3.1.4. Реципрокный анализ эффекта нерестовой воды береговых крабов 66
3.1.5. Очистка OHSS методом RP-HPLC 67
3.1.6. Частичное аминокислотное сиквенирование OHSS 68
3.1.7. Клонирование гена кодирующего OHSS 70
3.1.8. Анализ аминокислотной последовательности OHHS 72
3.1.9. Поиск последовательностей, гомологичных гену OHSS с использованием базы данных международного банка генов 72
3.1.10. Анализ структуры гена кодирующего OHSS и его активности 74
3.1.11. Пострансляционная модификация и активация OHSS 77
3.1.12. Использование поликлональных антител для детекции OHSS в тотальном белке эмбрионов 80
3.1.13. Посттранскрипционные изменения в структуре мРНК кодирующей OHSS и множественность локусов гена 81
3.1.14. Морфологические изменения в абдоменальных волоска: под дейтвием OHSS 83
3.1.15. Межвидовые различия в структуре OHSS 85
3.2. Инициация хатчинга эмбрионов в лаборатории и применение вычитающей гибридизации на модели программы нереста крабов 87
3.2.1. Инициация хатчинга эмбрионов - эффект органических соединений 87
3.2.2. Поиск генов специфичных для программы хатчинга с использованием вычитающей гибридизации 91
3.2.3. Анализ экспрессии и структуры гена кодирующего HSP-90 94
Обсуждение результатов 97
Выводы 107
Список литературы 109
