ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................................. 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................... 14
1.1. Бактериофаги и их разнообразие ............................................................................ 14
1.1.1. Жизненные циклы бактериофагов ........................................................................ 16
1.1.2. Классификация и номенклатура бактериофагов ................................................. 19
1.1.3. Пангеном бактериофагов ....................................................................................... 21
1.1.4. Структура генома хвостатых бактериофагов ...................................................... 23
1.2. Механизмы генетического разнообразия бактериофагов .................................... 29
1.2.1. Мутации в геномах бактериофагов....................................................................... 29
1.2.2. Мозаичная структура геномов бактериофагов .................................................... 30
1.3. Роль бактериофагов в эволюции бактерий ................................................................. 34
1.3.1. Бактериофаги – агенты горизонтального переноса генов между бактериями . 34
1.3.2. Бактериофаги – «орудие» в бактериальной адаптации и межвидовой конкуренции.................................................................................................................................. 36
1.4. Бактерии Bacillus cereus sensu lato ............................................................................... 40
1.5. Бактериофаги, инфицирующие представителей группы Bacillus cereus sensu lato 44
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................ 47
2.1. Материалы ...................................................................................................................... 47
2.1.1. Объекты исследования ........................................................................................... 47
2.1.2. Реактивы, ферменты, коммерческие наборы ....................................................... 48
2.1.3. Состав растворов и сред для культивирования ................................................... 49
2.1.4. Оборудование и приборы ...................................................................................... 50
2.2. Методы исследования ................................................................................................... 51
2.2.1. Общие методики ..................................................................................................... 51
2.2.2. Выделение, очистка и получение препаратов бактериофагов ........................... 52
2.2.3. Морфология бляшек бактериофагов .................................................................... 55
2.2.4. Трансмиссионная электронная микроскопия ...................................................... 55
3
2.2.5. Диапазон чувствительных к фаговой инфекции штаммов группы Bacillus cereus ........................................................................................................................................................ 55
2.2.6. Секвенирование, сборка и аннотация геномов бактериофагов ......................... 56
2.2.7. Определение стратегии упаковки ДНК ................................................................ 57
2.2.8. Сравнительный геномный анализ ......................................................................... 58
2.2.9. Определение температурной и рН стабильностей бактериофагов .................... 59
2.2.10. Анализ литической активности бактериофагов ................................................ 60
2.2.11. Анализ адсорбции бактериофагов (для Sam46) ................................................. 60
2.2.12. Одноступенчатая кривая роста бактериофагов (для Sam46) ........................... 61
2.2.13. Тест на возникновение лизогенного штамма B. cereus ВКМ В-370 (для Sam46) ........................................................................................................................................................ 61
2.2.14. Выявление генетических различий между фагами с мутным и прозрачным морфотипом бляшек (для Sam46 и Sam112) .............................................................................. 62
2.2.15. Статистический анализ ........................................................................................ 63
2.2.16. Регистрационные номера геномов ...................................................................... 63
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ........................................................................................................ 64
3.1. Вирулентные бактериофаги Sam46-T и Sam46-C ...................................................... 64
3.1.1. Выделение, спектр литического действия и морфология .................................. 64
3.1.2. Организация генома Sam46-T и Sam46-C ............................................................ 66
3.1.3. Выявление генетических различий между Sam46-T и Sam46-C ....................... 71
3.1.4. Определение стратегии упаковки ДНК ................................................................ 73
3.1.5. Сравнительный геномный анализ ......................................................................... 75
3.1.6. Определение температурной и рН стабильностей .............................................. 77
3.1.7. Анализ литической активности ............................................................................. 79
3.1.8. Анализ адсорбции и одноступенчатая кривая роста ........................................... 80
3.1.9. Тест на возникновение лизогенного штамма B. cereus ВКМ В-370 в ходе инфекции Sam46-T ....................................................................................................................... 81
3.2. Умеренный бактериофаг Kirov .................................................................................... 83
3.2.1. Выделение, спектр литического действия и морфология .................................. 83
4
3.2.2. Организация генома Kirov ..................................................................................... 84
3.2.3. Определение стратегии упаковки ДНК ................................................................ 87
3.2.4. Сравнительный геномный анализ ......................................................................... 88
3.2.5. Определение температурной и рН стабильностей .............................................. 91
3.2.6. Анализ литической активности ............................................................................. 91
3.3. Умеренный бактериофаг B13 ....................................................................................... 93
3.3.1. Выделение, спектр литического действия и морфология .................................. 93
3.3.2. Организация генома B13 ....................................................................................... 94
3.3.3. Определение стратегии упаковки ДНК ................................................................ 96
3.3.4. Сравнительный геномный анализ ......................................................................... 99
3.3.5. Определение температурной и рН стабильностей ............................................ 101
3.3.6. Анализ литической активности ........................................................................... 101
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ .......................................... 103
4.1. Структурная организация геномов бактериофагов. Метод RAGE ......................... 103
4.2. Характеристика исследуемых бактериофагов: основные физиологические параметры, геномный и филогенетический анализы ................................................................. 107
4.3. Вклад исследуемых бактериофагов в адаптацию и эволюцию бактерий группы Bacillus cereus sensu lato ................................................................................................................ 116
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ...................................................................................................................... 118
ВЫВОДЫ ................................................................................................................................ 121
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .................................................................................................... 122
СПИСОК ТЕРМИНОВ .......................................................................................................... 124
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................................... 125
ПРИЛОЖЕНИЕ А .................................................................................................................. 153
ПРИЛОЖЕНИЕ Б ................................................................................................................... 156
ПРИЛОЖЕНИЕ В ................................................................................................................... 159
ПРИЛОЖЕНИЕ Г ................................................................................................................... 161
ПРИЛОЖЕНИЕ Д .................................................................................................................. 163
5
ПРИЛОЖЕНИЕ Е ................................................................................................................... 165
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ................................................... 168
БЛАГОДАРНОСТИ ............................................................................................................... 171
