ОГЛАВЛЕНИЕ........................................................................................................... 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................8
ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................. 9
Актуальность исследования и современное состояние проблемы...............9
Цель и задачи работы.......................................................................................11
Научная новизна полученных результатов................................................... 11
Научная и практическая значимость ..............................................................12
Положения, выносимые на защиту................................................................ 13
Степень достоверности и апробация результатов........................................13
Личное участие автора .....................................................................................14
Публикации....................................................................................................... 14
Финансовая поддержка ....................................................................................14
Структура и объем диссертации.....................................................................15
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................ 16
1. Сnidaria как объект биологии развития..................................................... 16
1.1 Общий обзор филогенетического положения Cnidaria ................. 16
1.2 Установление оси тела и разнообразие типов гаструляции у
Cnidaria .............................................................................................................17
1.3 Устройство и разнообразие архитектур колоний гидроидных
полипов............................................................................................................203
1.4 Dynamena pumila - перспективный объект биологии развития....22
2. Канонический сигнальный путь Wnt ( cWnt) в развитии Metazoa .........25
2.1 Канонический сигнальный путь Wnt (cWnt).................................. 26
2.2 Краткий обзор участия сигнального пути Wnt в разметке оси тела
и спецификации зародышевых листков у Bilateria .....................................29
2.3 Роль сигнального пути cWnt в спецификации зародышевых
листков у Cnidaria ...........................................................................................33
2.4 Роль сигнального пути cWnt в установлении оси тела у Cnidaria 35
2.5 Роль сигнального пути cWnt в формировании колонии
гидроидных полипов......................................................................................41
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................................43
Организмы.........................................................................................................43
Реактивы............................................................................................................ 43
Среды......................................................................................................... 43
Буферы и растворы общего пользования.............................................. 43
Буферы и растворы для гибридизации in situ....................................... 45
Коммерческие наборы............................................................................. 46
Ферменты (не из коммерческих наборов)............................................. 47
Реактивы....................................................................................................47
Модуляторы.............................................................................................. 48
1- азакенпауллон (Sigma Cat #A3734, Канада);.................................... 48
iCRT-14 (Sigma Cat #SML0203, США)..................................................484
Антитела ....................................................................................................48
Праймеры.................................................................................................. 48
Оборудование ....................................................................................................49
Сбор материала .................................................................................................50
Модуляция канонического сигнального пути Wnt (сWnt)
фармакологическими модуляторами................................................................... 50
Цейтраферная микроскопия............................................................................52
Световая и электронная микроскопия........................................................... 52
Фиксация ................................................................................................... 52
Световая микроскопия и ТЭМ................................................................52
СЭМ........................................................................................................... 54
Иммунофлуоресцентный анализ.................................................................... 54
Исследование пролиферации клеток............................................................. 55
Клонирование генов интереса и синтез анти-смысловых РНК-зондов..... 55
ПЦР с обратной транскрипцией............................................................. 55
Получение целевого фрагмента исследуемого гена ............................ 57
Очистка продукта амплификации.......................................................... 58
Электрофорез в агарозном геле .............................................................. 58
Лигирование ..............................................................................................59
Трансформация компетентных клеток.................................................. 59
Отбор клонов............................................................................................ 595
Подготовка матриц для синтеза РНК-зондов........................................60
Синтез анти-смысловых РНК-зондов.................................................... 61
Очистка продукта транскрипции............................................................61
Гибридизация in situ.........................................................................................61
Фиксация ................................................................................................... 62
1 день гибридизации................................................................................ 62
2 день гибридизации................................................................................ 63
3 день гибридизации................................................................................ 63
4 день гибридизации............................................................................... 63
Фотосъёмка ....................................................................................................... 64
Анализ и обработка изображений.................................................................. 64
РЕЗУЛЬТАТЫ...........................................................................................................65
1. Описание нормального эмбрионального развития D. pumila................. 65
1.1 Дробление ........................................................................................... 65
1.2 Бластула/морула ................................................................................. 68
1.3 Ранняя гаструла: начало вторичной деламинации.........................70
1.4 Средняя гаструла ................................................................................73
1.5 Поздняя гаструла ................................................................................75
1.7 Адгезия и распластывание эмбрионов D. pumila........................... 77
1.8 Паренхимула/препланула ..................................................................79
1.9 Планула ................................................................................................816
1.10 Анализ пространственной динамики пролиферации клеток в
ходе развития D. pumila.................................................................................83
2. Оценка участия сигнального пути cWnt в спецификации зародышевых
листков и становлении орально-аборальной полярности в ходе развития D. pumila ....................................................................................................................... 86
2.1 Анализ пространственной динамики экспрессии генов-маркёров
энтодермы в ходе развития D. pumila.......................................................... 86
2.2 Оценка влияния сигнального пути сWnt на ход гаструляции и
спецификацию зародышевых листков.........................................................87
2.3 Анализ становления разметки орально-аборальной оси
компонентами сигнального пути cWnt и его генами-мишенями в ходе
развития D. pumila..........................................................................................90
2.4 Оценка влияния активности сигнального пути cWnt на
формирование орально-аборальной полярности в ходе развития D. pumila............................................................................................................... 95
2.5 Анализ пространственной динамики экспрессии генов Wnt у
препланул и планул D. pumila.......................................................................96
3. Оценка участия лигандов Wnt и сигнального пути cWnt в становлении
архитектуры колонии D. pumila............................................................................97
3.1 Анализ пространственной динамики экспрессии генов Wnt в ходе
морфогенеза верхушки роста побега ........................................................... 98
3.2 Анализ пространственной динамики экспрессии участников и
генов-мишеней сигнального пути сWnt в ходе морфогенеза верхушки
роста побега ...................................................................................................1047
3.3 Анализ пространственной динамики экспрессии эндогенных
ингибиторов сигнального пути cWnt в ходе морфогенеза верхушки роста
побега .............................................................................................................108
ОБСУЖДЕНИЕ.......................................................................................................110
1. Морфологическая ось определяется поздно в ходе нормального
развития D. pumila................................................................................................ 110
2. Гаструляционные морфогенезы и спецификация зародышевых листков
протекают аполярно и не зависят от опосредованной сигнальным путём cWnt
разметки орально-аборальной оси......................................................................117
3. Wnt лиганды и компоненты сигнального пути сWnt осуществляют
разметку верхушки роста побега в колонии D. pumila.................................... 124
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................................................128
ВЫВОДЫ................................................................................................................ 130
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................131
