Введение
ГЛАВА 1. История изучения иммунологических аспектов взаимоотношений в системах «паразиты – хозяева»
ГЛАВА 2. Материалы и методы 35
2.1. Материалы для исследований 35
2.2. Инкубирование плероцеркоидов цестод 38
2.3. Сканирующая электронная микроскопия 39
2.4. Трансмиссионная электронная микроскопия 39
2.5. Иммуцитохимия 40
2.6. Биохимическое исследование простагландинов
2.6.1. Подготовка проб для выявления и количественной оценки проста-гландинов 42
2.6.2. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография c ультрафиолетовым детектированием (ОФ-ВЭЖХ-УФ) 42
2.6.3. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография с детектированием на масс-спектрометре (ОФ-ВЭЖХ-МС) 43
2.6.4. Приготовление стандартных растворов PGE2 and PGD2 для количественного анализа 43
2.7. Исследование in vitro влияния потенциальных иммунорегуляторов на лейкоциты рыб 44
2.7.1. Разведение G. aculeatus и S. solidus 44
2.7.2. Эксперименты по заражению 44
2.7.3. Приготовление антигенов S. solidus 45
2.7.4. Приготовление культуральной среды 46
2.7.5. Изоляция лейкоцитов 46
2.7.6. Культивирование лейкоцитов 47
2.7.7. Проточная цитофлуориметрия 47
2.7.8. Измерение продукции реактивных форм кислорода лейкоцитами головной почки 48
2.8. Исследование лейкоцитарного состава органов иммунной системы рыб 49
2.9. Исследование гистоморфологии иммунокомпетентных органов и тканей окончательного хозяина 50
2.10. Исследование экспрессии иммунокомпетентных генов рыб 51
2.10.1. Экспериментальные животные: получение ARS-Fp-R и ARS-Fp-S генетических линий радужной форели 51
2.10.2. Отбор проб 52
2.10.3. Определение в селезенке рыб уровня патогенной нагрузки F. psy-chrophilum методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени 53
2.10.4. Выделение РНК 53
2.10.5. Анализ экспрессии генов 54
2.11. Статистический анализ данных 55
ГЛАВА 3. Микроморфологические изменения цестод при воздействии сыворотки крови их хозяев 58
3.1. История изучения адаптаций цестод к воздействию иммунными факторами их хозяев 58
3.2. Исследование секреторной активности тегумента плероцеркоидов Diphyllobothrium dendriticum при воздействии сыворотки крови хозяина Coregonus migratorius 62
3.2.1. Исследование с помощью методов сканирующей электронной микроскопии 62
3.2.2. Исследование с помощью методов трансмиссионной электронной микроскопии 67
3.3. Исследование секреторной активности тегумента плероцеркоидов Ligula (Digramma) interrupta при воздействии сыворотки крови хозяина Carassius auratus 76
3.3.1. Исследование с помощью методов сканирующей электронной мик 4 роскопии 76
3.3.2. Исследование с помощью методов трансмиссионной электронной микроскопии 78
3.4. Сравнительный анализ микроморфологических изменений в тегументе D. dendriticum и L. interrupta при воздействии сыворотки крови их хозяев 84
ГЛАВА 4. Наличие и особенности распределения иммунорегуляторных молекул в организме цестод, паразитирующих в рыбах 93
4.1. История изучения иммунорегуляторных молекул паразитов 93
4.2. Иммуноцитохимическое и биохимическое исследование D. dendriticum 96
4.2.1. Выявление простагландинов 96
4.2.1.1. Выявление простагландина E2 97
4.2.1.1.1. PGE2-ИР в нервной системе 97
4.2.1.1.2. PGE2-ИР в циртоцитах 97
4.2.1.1.3. PGE2-ИР в тегументе 98
4.2.1.2. Выявление простагландина D2 99
4.2.2. Ультраструктурное исследование структур, участвующих в синтезе PGE2 и PGD2 100
4.2.3. Выявление нейроактивных субстанций
4.2.3.1. Выявление -аминомасляной кислоты (ГАМК) 102
4.2.3.2. Выявление серотонина 103
4.2.3.3. Выявление неропептида FMRFамида 104
4.2.3.4. Выявление ко-локализации нейроактивных субстанций в нервной 105 системе
4.2.4. Биохимическое исследование D. dendriticum 106
4.2.4.1. Выявление и количественный анализ простагландинов E2 и D2 в плероцеркоидах 106
4.2.4.2. Динамика секреции простагландинов E2 и D2 при инкубировании с сывороткой крови хозяина 106
4.3. Иммуноцитохимическое исследование Ligula (Digramma) interrupta 107
4.3.1. Выявление простагландинов 107
4.3.1.1. Выявление простагландина E2 107
4.3.1.2. Выявление простагландина D2 109
4.3.3. Выявление нейроактивных субстанций
4.3.3.1. Выявление серотонина 110
4.3.3.2. Выявление неропептида FMRFамида 110
4.3.3.3. Выявление -аминомасляной кислоты (ГАМК) 111
4.3.3.4. Выявление ко-локализации нейроактивных субстанций в нервной системе
4.4. Анализ иммунорегуляторов Diphyllobothrium dendriticum и Ligula (Di gramma) interrupta 113
ГЛАВА 5. Исследование регуляторного влияния цестод на иммунную систему их хозяев – рыб 126
5.1. Строение, механизмы функционирования иммунной системы рыб и иммунный ответ при инфекциях и паразитозах 126
5.2. Исследование in vitro влияния потенциальных иммунорегуляторных молекул цестод на показатели лейкоцитов трехиглой колюшки Gasterosteus aculeatus 137
5.2.1. Влияние простагландина E2 138
5.2.1.1. Влияние простагландина E2 на лейкоциты головной почки при краткосрочном воздействии 138
5.2.1.1.1. Количество лейкоцитов и их субпопуляций 138
5.2.1.1.2. Кислородный взрыв 139
5.2.1.2. Влияние простагландина E2 на лейкоциты головной почки при долгосрочном воздействии 139
5.2.1.2.1. Количество лейкоцитов 140
5.2.1.2.2. Субпопуляции лейкоцитов 140
5.2.1.2.3. Кислородный взрыв 141
5.2.2. Влияние нейромедиатора серотонина (5-HT) 141
5.2.2.1. Влияние серотонина на лейкоциты головной почки при кратко срочном воздействии 142
5.2.2.1.1. Количество лейкоцитов и их субпопуляций 142
5.2.2.1.2. Кислородный взрыв 142
5.2.2.2. Влияние серотонина на лейкоциты головной почки при долгосрочном воздействии 142
5.2.2.2.1. Количество лейкоцитов 143
5.2.2.2.2. Субпопуляции лейкоцитов 143
5.2.2.2.3. Кислородный взрыв 144
5.2.3. Влияние нейромедиатора -аминомасляной кислоты (ГАМК) 144
5.2.3.1. Влияние ГАМК на лейкоциты головной почки при краткосроч ном воздействии 144
5.2.3.1.1. Количество лейкоцитов и их субпопуляций 144
5.2.3.1.2. Кислородный взрыв 145
5.2.3.2. Влияние ГАМК на лейкоциты головной почки при долгосрочном воздействии 145
5.2.3.2.1. Количество лейкоцитов 145
5.2.3.2.2. Субпопуляции лейкоцитов 146
5.2.3.2.3. Кислородный взрыв 146 5.3. Исследование изменений лейкоцитарного состава органов иммунной
системы рыб при заражении плероцеркоидами цестод 146
5.3.1. Исследование изменений лейкоцитарного состава органов иммунной системы байкальского омуля С. migratorius при заражении плероцерко идами лентеца чаечного D. dendriticum 147
5.3.1.1. Качественные характеристики лейкоцитарного состава органов иммунной системы байкальского омуля 147
5.3.1.2. Изменение лейкоцитарного состава головного отдела почки байкальского омуля при заражении D. dendriticum 148
5.3.1.3. Изменение лейкоцитарного состава туловищного отдела почки байкальского омуля при заражении D. dendriticum 148
5.3.1.4. Изменение лейкоцитарного состава селезенки байкальского омуля при заражении D. dendriticum 148
5.3.2. Исследование изменений лейкоцитарного состава органов иммунной системы карася серебряного С. auratus при заражении плероцеркоидами 149 ремнеца L. interrupta
5.3.2.1. Качественные характеристики лейкоцитарного состава органов иммунной системы карася серебряного 149
5.3.2.2. Изменение лейкоцитарного состава головного отдела почки карася серебряного при заражении L. interrupta 150
5.3.2.3. Изменение лейкоцитарного состава туловищного отдела почки карася серебряного при заражении L. interrupta 150
5.3.2.4. Изменение лейкоцитарного состава селезенки карася серебряного при заражении L. interrupta 151
5.4. Исследование у окончательных хозяев микроморфологических изменений органов, принимающих участие в антипаразитарном иммунологическом ответе, при экспериментальном заражении цестодами 152
5.4.1. Изменение клеточного состава брыжеечных лимфатических узлов сирийского хомяка при экспериментальном заражении D. dendriticum 152
5.4.2. Изменение состава тучных клеток 12-перстной кишки сирийского хомяка при экспериментальном заражении D. dendriticum 153
5.5. Исследование изменений экспрессии иммунокомпетентных генов у радужной форели Oncorhynchus mykiss при заражении флавобактериями Fla vobacterium psychrophilum 154
5.5.1. Динамика изменений количества бактерий Fp в селезенке ARS-Fp-R- и ARS-Fp-S-линий форели после заражения 155
5.5.2. Анализ изменений экспрессии генов при заражении Fp методом принципиальных компонент 156
5.5.3. Попарный анализ экспрессии генов при заражении Fp 156
5.5.4. Сравнительный анализ ответной реакции на заражение Fp между генетическими линиями 158
5.5.5. Сравнение базовой и индуцированной генной экспрессии между генетическими линиями 159
5.6. Анализ регуляторного влияния цестод на иммунную систему их хозяев – рыб 160
ГЛАВА 6. Анализ иммунологических аспектов взаимоотношений в системах «цестоды – рыбы » 184
Заключение 210
Список сокращений и условных обозначений 215
Список литературы
