Введение
1. Введение 5
2. Теоретические и практические аспекты метода молекулярной гибридизации 8
2.1 Типы гибридизационного анализа 10
2.1.1. Гомофазная гибридизация в растворе 10
2.1.2. Гетерофазная гибридизация 14
2.1.2.1. Гибридизация на частицах и иммунологических планшетах 16
2.1.2.1.1. Гибридизация на мелкодисперсных частицах 16
2.1.2.1.2. Гибридизация на наночастицах 16
2.1.2.1.3. Гибридизация на иммунологических планшетах 18
2.1.2.2. Гибридизация в слое геля 19
2.1.2.3. Гибридизация на плоских поверхностях 21
2.2. Эффективность и кинетика гибридизации (теоретические аспекты) 23
2.2.1. Гибридизация в растворе 23
2.2.2. Гетерофазная гибридизация 25
2.2.2.1. Носитель - микрочастица 25
2.2.2.2. Носитель - слой геля 27
2.2.2.3. Носитель - плоская поверхность 27
2.3. Структура пробы и зонда как фактор, влияющий на эффективность процесса гибридизации 30
2.3.1. Структура пробы в гетерофазной гибридизации : 30
2.3.2. Дизайн и структура зонда в гетерофазной гибридизации 33
2.3.2.1. Зонды, содержащие модифицированные основания 37
2.3.2.2. Зонды, содержащие модифицированный рибозофосфатный остов 37
2.3.2.3. Зонды, содержащие вставки в рибозофосфатном остове 40
2.4. Проблемы селективности параллельной гибридизации с набором олигонуклеотидных зондов 44
2.4.1. Буфер 45
2.4.2. Модифицированные основания 46
2.4.3. Фермент-зависимые реакции, используемые в гибридизационном анализе 51
2.5. Заключение 53
3. Результаты и обсуждение 55
3.1. Влияние ненуклеотидиой вставки в составе «мостикового» олигонуклеотида на его гибридизационные свойства 55
3.1.1. Схема формирования комплекса, содержащего «мостиковый» олигонуклеотид 58
3.1.2. Определение термодинамических параметров комплексов, содержащих «мостико вый» олигонуклеотид 61
3.1.3. Влияние позиции ненуклеотидиой вставки в составе «мостикового» олигонуклеотида на его гибридизационные свойства 69
3.1.3.1. Олигонуклеотиды, содержащие одну мономерную вставку в разных положениях олигонуклеотидной цепи 69
3.1.3.2. Олигонуклеотиды, содержащие несколько моиомерных вставок в разных положениях олигонуклеотидной цепи 72
3.2. Сравнение алішлирования модельной ДНК-мишени реакционноспособными производными нативных и «мостиковых» олигонуклеотидов 74
3.3. «Мостиковых» олигонуклеотиды и их комплексы с ДНК как субстраты в ферментативных реакциях 77
3.3.1. «Мостиковые» олигонуклеотиды в реакциях, катализируемых фосфодиэстеразои змеиного яда 77
3.3.2. Субстратные свойства комплексов, содержащих «мостиковые» олигонуклеотиды, в реакциях, катализируемых Т4 ДНК-лигазой 19
3.3.2.1. Влияние однонуклеотидного несоответствия в составе ДНК-матрицы на эффективность лигирования тандема с участием «мостикового» олигонуклеотида 82
3.3.3. Субстратные свойства комплексов, содержащих «мостиковые» олигонуклеотиды, в реакциях, катализируемых Га^-полимеразой 84
3.3.3.1. Элонгация «мостиковых» олигонуклеотидов под действием Гад-полимеразы 84
3.3.3.2. «Мостиковые» олигонуклеотиды в качестве матричной цепи в реакциях, катализируемых Га^-полимеразой 87
3.3.3.3. Эффективность удлинения «мостиковых» олигонуклеотидов 7а<7-полимеразой на матрицах, содержащих однонуклеотидное несоответствие 91
3.4. «Мостиковые» олигонуклеотиды как зонды в методе молекулярной гибридизации 95
3.4.1. Выбор олигонуклеотидных зондов 95
3.4.2. Иммобилизованные «мостиковые» олигонуклеотиды как зонды в методе молекулярной гибридизации 97
3.4.2.1. «Мостиковые» зонды и ДНК-зависимые ферменты в методе молекулярной гибридизации 102
3.4.3. Использование «мостиковых» олигонуклеотидов в качестве зондов в ДНК-диагностике 106
3.4.3.1. Использование «мостиковых» олигонуклеотидов для выявления ВКЭ 106
3.4.3.2. Использование «мостиковых» зондов для выявления и генотипирования ВГС 107
3.5. Заключение 111
4. Экспериментальная часть 112
4.1. Исходные материалы 112
4.2. Основные методы 114
4.4. Основные методики 117
Выводы 120
