Введение
1 Литературный обзор 13
1.1 Пенициллинацилаза 13
1.1.1 Общие сведения 13
1.1.1.1 Физиологическая роль ПА 13
1.1.1.2 Каталитическая активность 13
1.1.1.3 Субстратная специфичность 14
1.1.1.4 Стереоспецифичность 16
1.1.2 Основные области применения ПА 17
1.1.2.1 Получение бета-лактамных антибиотиков 17
1.1.2.2 Разделение энантиомеров аминосоединений 22
1.1.3 Структурно-функциональные особенности ecПА 24
1.1.3.1 Структура предшественника 24
1.1.3.2 Активный центр 24
1.1.3.3 Механизм катализа 25
1.1.3.4 Конформационные переходы в активном центре. 27
1.1.3.5 Участок связывания ацильной части. 29
1.1.3.6 Участок связывания амидной части. 30
1.1.3.7 Локализация участка связывания бета-лактамных нуклеофилов 32
1.2.Белковая инженерия и поиск новых ПА 34
1.2.1 Поиск природных ПА 36
1.2.2 Белковая инженерия ПА
1.2.2.1 Случайный мутагенез 44
1.2.2.2 Направленный мутагенез 48
1.2.2.3 Комбинированные методы 57
1.2.2.4 Расширение возможностей белковой инженерии 63
1.2.3 Заключение 66
2 Материалы и методы 68
2.1 Материалы и оборудование 68
2.2 Методы 71
2.2.1 QuikChange ПЦР мутагенез 71
2.2.2 ПЦР мутагенез с перекрыванием 72
2.2.3 Наработка биомассы 73
2.2.4 Выделение и очистка мутантных препаратов ПА 73
2.2.5 Приготовление компетентных клеток 74
2.2.6 Электрофорез в агарозном геле 75
2.2.7 Электрофорез в полиакриламидном геле 75
2.2.8 Секвенирование 77
2.2.9 Титрование активных центров 77
2.2.10 Определение кинетических параметров гидролиза цветного субстрата 77
2.2.11 Изучение pH- и термостабильности 77
2.2.12 Ингибиторный анализ 78
2.2.13 Определение параметра S/H 78
2.2.14 Определение параметров и 79
2.2.15 Определение параметра 79
2.2.16 Определение максимального выхода реакции 79
2.2.17 Определение стереоселективности в реакции ацилирования 2-аминобутанола и фенилаланинола
2.2.18 Определение стереоселективности в реакции гидролиза
фенилацетилфенилаланинола 80
2.2.19 ВЭЖХ 81
2.2.20 Компьютерное моделирование 83
2.2.21 Методы статистической обработки результатов 83
3 Результаты и обсуждение 84
3.1 Постановка задачи 84
3.2 Получение генов мутантных форм 87
3.3 Экспрессия, выделение и очистка 93
3.4 Титрование активных центров, каталитическая активность и термостабильность 95
3.5 Эффективность синтеза 99
3.5.1 Определение параметров а,р,у 99
3.5.2 Уточнение к вычислению параметра а 103 .
3.6 Стереоселективность 105
3.7 Анализ экспериментальных данных 112
3.8 Мутагенез для изменения каталитической активности 117
3.8.1 Мутации bSIT, bSIC, bT68S, bSlT+bT68S 117
3.8.2 Мутации Ы177V, bW154F 120
3.9 Мутагенез для изменения эффективности синтеза 122
3.9.1 Мутации bF24A, bF24A+bF71L, bF24A+bF71L+bF256R 122
3.9.2 Мутация aS149R 129
3.9.3 Мутация bN388Q 132
3.9.4 Мутации bF256R, bA255R 136
3.10 Мутагенез для изменения стереоселективности 143
3.10.1 Мутации bF71L, bF71A 143
3.11 Мутагенез для изменения стабильности 149
3.11.1 Мутации bQ292R, bI329E 149
3.11.2 Мутации bD484N, bD484H 152
3.11.3 Мутация bR297A 158
3.11.5 Мутация aA173C+bA410C 161
3.11.6 Мутации bR533C+bW500C, bM485R 162
Основные результаты и выводы 164
Список литературы 165
