Введение
ГЛАВА 1. Современные представления о механизмах репарации повреждений днк (обзор литературы) 13
1.1 Система репарации ДНК в клетках эукариот 13
1.1.1 Сигнальные механизмы при двунитевых разрывах ДНК. 15
1.1.2 Механизмы репарации двунитевых разрывов ДНК . 20
1.1.2.1 Репарация двунитевых разрывов по механизму негомологичного соединения концов ДНК 21
1.1.2.2 Репарация двунитевых разрывов по механизму гомологичной рекомбинации. 24
1.1.3. Клинические синдромы, обусловленные дефектами репарации повреждений ДНК 25
1.2 Роль поли(АДФ-рибоза)полимеразы в механизмах репарации повреждений ДНК 29
1.2.1 Структура и ферментативная активность поли(АДФ-рибоза)полимеразы 29
1.2.1 Поли(АДФ-рибоза)полимераза вовлечена в процессы репарации различных по природе повреждений ДНК 32
1.3 Роль белка PML в механизмах репарации повреждений ДНК 35
1.3.2 Ядерные тельца белка PML – активные макромолекулярные структуры, опосредующие его функциональную активность 39
1.3.2.1 Ядерные тельца белка PML принимают участие в процессах программированной клеточной гибели. 40
1.3.2.2 Ядерные тельца белка PML и механизмы репарации повреждений ДНК. 41
1.3.4 Механизмы снижения экспрессии белка PML в клетках 44
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Характеристика объекта и предмета исследования 46
2.2. Хранение, культивирование и пассирование клеточных культур линий BJ, U-2 OS . 46
2.3. Нокдаун белков PML и PARP в клетках линий BJ и U-2 OS методом РНК-интерференции 48
2.3.1. Трансфекция короких интерфирирующих РНК (киРНК) 48
1.4. Индукция повреждений ДНК (генотоксический стресс ) в клетках линий BJ и U-2 OS с помощью химиопрепаратов. 49
1.5. Анализ экспрессии белков методом иммуноблотинга (Вестерн блоттинг) 50
2.5.1. Подготовка лизатов 50
2.5.2. Приготовление полиакриламидного геля 51
2.5.3. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 53
2.5.4. Перенос на белков нитроцеллюлозную мембрану (Трансфер). 54
2.5.5. Блокирование и окрашивание нитроцеллюлозной мембраны. 55
2.5.6. Анализ экспрессии белков методом хемилюминесцентной детекции. 56
2.6 Исследование экспресии белков методом иммунофлуоресцентной
микроскопии. 57
2.7. Исследование накопления -галактозидазы в клетках с помощью окраскиреагентом X-gal. 58
2.7.1. Приготовление растворов для окрашивания. 58
2.7.2. Протокол окрашивания клеток . 59
2.8. Оценка жизнеспособности клеток с помощью МTS-теста. 59
2.7.1. Приготовление рабочих растворов для MTS-теста. 60
2.8.1. Культивирование клеток для MTS-теста и интерпретация результатов 61
2.9 Статистическая обработка полученных результатов 61
ГЛАВА 3. Результаты исследований 62
3.1 Нокдаун белков PML и PARP-1 короткими интерферирующими РНК (киРНК) 62
3.2 Изучение активности поли (АДФ-рибоза)-полимеразы в условиях нокдауна белка PML 65
3.3 .Исследование роли белков PML и PARP в процессах репарации повреждений ДНК
4 3.4 Исследование жизнеспособности нормальных и опухолевых клеток в условиях генотоксического стресса и нокдауна белков PARP и PML 74
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 81
Выводы 90
Заключение 91
Практические рекомендации 93
Список сокращений 94
Список литературы 95
