Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1.1 Плюрипотентные стволовые клетки 12
1.1.1 Репрограммирование соматических клеток к плюрипотентному состоянию с помощью транскрипционных факторов 13
1.1.2 Гетерогенность исходной популяции как причина дифференциальной способности клеток к репрограммированию 14
I.1.2.1 Снижение гетерогенности репрограммируемых клеток: Полицистронные кассеты 15
I.1.2.1 Снижение гетерогенности репрограммируемых клеток: Вторичные репрограммируемые системы 16
1.1.3 Модель seesaw: репрограммирующие факторы как регуляторы дифференцировки 18
1.2 Основные этапы репрограммирования соматических клеток в ИПСК 20
1.2.1 Ранняя стадия репрограммирования 21
1.2.1.1 Увеличение скорости пролиферации клеток и подавление программы апоптоза 22
1.2.1.2 Мезенхимально-эпителиальный переход 24
1.2.2 Промежуточная стадия репрограммирования 26
I.2.3 Финальная стадия репрограммирования/Фаза стабилизации 28
I.3 «Project Grandiose». Альтернативные пути репрограммирования 30
I.4 Модели репрограммирования 43
1.4.1 Элитарные модели 43
1.4.1.1 Индуцированная элитарная модель 43
1.4.1.2 Элитарная модель
1.4.2 Стохастическая модель 45
1.4.3 Детерминистическая модель 46
1.4.4 Синтез стохастической и детерминистической модели 48
Глава II. Материалы и методы 50
11.1 Материалы 50
11.1.1 Клеточные линии 50
11.1.2 Вычислительные ресурсы 50
11.2 Методы 50
II.2.1 Молекулярно-биологические методы 50
11.2.1.1 Электрофорез в агарозном геле 50
11.2.1.2 Выделение ДНК из агарозного геля 50
11.2.1.3 Осаждение ДНК этанолом 50
11.2.1.4 Амплификация ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) 51
11.2.1.5 Определение первичной структуры ДНК 51
11.2.1.6 Очистка ДНК с использованием Sephadex G50 51
11.2.1.7 Выделение плазмидной ДНК 51
11.2.1.8 Выделение геномной ДНК 52
11.2.1.9 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
11.2.1.10 Лигазная реакция 52
11.2.1.11 Трансформация электрокомпетентных клеток E.coli
11.2.2 Лентивирусные векторы 53
11.2.3 Получение библиотеки баркодированных лентивирусных векторов 53
II.2.3 Амплификация и секвенирование ДНК-баркодов репрограммированных клеток 54
11.3 Компьютерный анализ 56
11.3.1 Биоинформатическая обработка результатов секвенирования 56
11.3.2 Компьютерное моделирование и статистический анализ 56
11.4 Методы работы с клеточными культурами 58
11.4.1 Культуральные среды 58
11.4.2 Получение культуры первичных эмбриональных фибробластов 58
11.4.3 Культивирование фибробластов 59
11.4.4 Размораживание клеток 59
11.4.5 Замораживание клеток 59
11.4.6 Получение вирусных частиц 59
11.4.7 Сортировка Thy1.2-позитивных клеток с помощью проточной цитофлуорометрии 60
11.4.8 Репрограммирование эмбриональных фибробластов мыши к плюрипотентному состоянию 60
11.4.9 Определение времени удвоения клеточной популяции и количества потомков трансдуцированных клеток 61
11.4.10 Получение контрольных клеток 61
Глава III. Результаты 62
111.1 Схема эксперимента 62
111.2 Пилотный эксперимент по репрограммированию баркодированных фибробластов мыши к плюрипотентному состоянию 64
111.3 Параметры, определяющие эффективность баркодирования клеток
111.3.1 Разнообразие библиотеки баркодированных вирусов 67
111.3.2 Количество интеграций баркодов на одну клетку 68
111.3.3 Количество потомков исходных клеток 70
III. 4 Репрограммирование баркодированных фибробластов мыши к плюрипотентному состоянию: Эксперименты 1 и 2 (Несортированные ЭФМ) 71
111.5 Секвенирование контрольных клеток с известными ДНК-баркодами 72
111.6 Анализ потери материала в ходе получения библиотеки (Секвенирование 3х5000 баркодированных клеток) 74
111.7 Оценка размера библиотеки баркодированных лентивирусных векторов 75
111.8 Описание компьютерной модели, симулирующей экспериментальные стадии 76
111.9 Компьютерное моделирование Экспериментов 1 и 2
111.10 Репрограммирование баркодированных фибробластов мыши к плюрипотентному состоянию: Эксперимент 3 (ЭФМ, сортированные по Thy-1) и Контрольный эксперимент 79
111.11 Анализ вклада быстроделящихся клеток в общее число двойных пересечений 82
111.12 Компьютерное моделирование двойных, тройных и четверных пересечений баркодов при дифференциальной способности клеток к репрограммированию 82
Глава IV. Обсуждение 84
IV.1 Оценка разнообразия библиотеки баркодированных лентивирусов 85
IV.2 Оценка наследуемости способности к репрограммированию через моделирование экспериментальных данных 86
Выводы 90
Благодарности 91
Список литературы 92
