Введение
Глава 1. Неферментативное образование фосфодиэфирной связи между фрагментами рнк (реакция лигирования) (обзор литературы) 8
1.1 Введение 8
1.2 Конденсирующие агенты - карбодиимиды и бромциан 9
1.3 Активированные производные фосфата 24
1.3.1 Лигирование фосфоримидазолидных производных нуклеиновых кислот 25
1.3.2 Лигирование 2,3-циклофосфат-содержащих нуклеиновых кислот 33
1.3.3 Лигирование 5-трифосфат-содержащих нуклеиновых кислот 35
1.4 Рибозимы 37
1.5 Заключение 43
Глава 2. Неферментативная рекомбинация молекул рнк в реакциях расщепления / лигирования (результаты и обсуждение) 45
2.1 Исследование матрично-направленной реакции лигирования олигонуклеотидов, несущих 2,3-циклофосфат 45
2.1.1 Выбор модели, дизайн олигонуклеотидов 45
2.1.2 Зависимость эффективности реакции лигирования от рн буфера и присутствия ионов магния 47
2.1.3 Кинетика реакции неферментативного лигирования и выбора длительности инкубации для исследования реакции 50
2.1.4 Зависимость выхода продукта лигирования от температуры 53
2.1.5 Зависимость эффективности реакции лигирования от рн и присутствия ионов металлов 55
2.1.6 Влияние этилового спирта и хлорида натрия на эффективность образования продукта лигирования 59
2.1.7 Заключение 60
2.2 Анализ образующейся фосфодиэфирной связи 60
2.2.1 Обоснование метода 60
2.2.2 Анализ образующейся связи методами ферментативного и щелочного гидролиза 61
2.3 Исследование матрично-направленной комбинированной реакции расщепления/лигирования химерного днк/рнк олигонуклеотида. 65
2.3.1 Выбор модели 65
2.4 Рекомбинация молекул рнк через сопряженные акты расщепления/лигирования в присутствии комплементарной матрицы 67
2.4.1 Выбор модели 67
2.4.2 Влияние ионов металлов на эффективность протекания реакции расщепления/лигирования 70
2.4.3 Влияние температуры на эффективность образования продуктов лигирования 72
2.4.4 Скорость накопления продукта лигирования 74
2.4.5 Влияние соотношения концентраций олигонуклеотидов на эффективность образования продукта лигирования 76
2.4.6 Анализ образующейся связи методом ферментативного гидролиза 77
2.5 Значение полученных результатов 79
Глава 3. Материалы и методы 84
3.1 Введение [32р]-метки по 5-концу олигонуклеотида 86
3.2 Гидролиз фосфодиэфирной связи гидроксидом натрия 87
3.3 Получение олигонуклеотидов с 2,3-циклофосфатом на з-конце 87
3.4 Гидролиз г.з-циклофосфата 87
3.5 Получение двуцепочечного комплекса олигонуклеотидов 88
3.6 Изучение влияния рн на эффективность образования продуктов лигирования 88
3.7 Изучение эффективности образования продуктов лигирования в присутствии ионов металлов 89
3.8 Выделение продуктов лигирования 90
3.9 Ферментативное расщепление продуктов лигирования рибонуклеазой т1 91
3.10 Расщепление продукта лигирования при рн 9.0 в присутствии ионов мд2+ 91
3.11 Дефосфорилирирование олигонуклеотидов щелочной фосфатазой 91
3.12 Ферментативное лигирование олигонуклеотидов с помощью днк-лигазы 92
Выводы 93
Список литературы
