Введение
1 Обзор литературы 12
1.1 Костные морфогенетические белки – факторы роста и регенерации костной ткани 12
1.1.1 Общая характеристика группы BMP 12
1.1.2 Строение, биосинтез и механизм действия BMP-2 13
1.1.3 Функции BMP в организме 17
1.2 Способы получения препаратов биологически активного белка BMP-2 18
1.2.1 Выделение и очистка белка из костного матрикса 18
1.2.2 Выделение rhBMP-2 из эукариотических продуцентов 19
1.2.3 Выделение из прокариотических продуцентов
1.3 Оптимизация экспрессии и очистка димерной формы rhBMP-2, полученного микробиологическим синтезом 22
1.4 Остеопластические материалы – перспективы применения в медицине и ветеринарии
1.4.1 Требования к современным остеопластическим материалам 25
1.4.2 Тестирование активности остеопластических материалов 26
1.4.3 Многообразие остеопластических материалов 28
1.4.4 Остеоиндуктивные материалы с добавлением BMP и их клиническое применение в медицине и ветеринарии 36
2 Экспериментальная часть 40
2.1 Материалы и реактивы 40
2.1.1 Генно-инженерные конструкции 40
2.1.2 Бактериальные штаммы-продуценты 40
2.1.3 Питательные среды 40
2.1.4 Реагенты и ветеринарные препараты 40
2.1.5 Оборудование и программное обеспечение 41
2.1.6 Лабораторные животные 43
2.2 Основные методики 43
2.2.1 Подготовка компетентных клеток E. сoli для трансформации плазмидной ДНК электропорацией 43
2.2.2 Трансформация клеток E. сoli 44
2.2.3 Выращивание штамма-продуцента белка BMPRIA-CBD 44
2.2.4 Электрофорез белков в ПААГ-ДСН 46
2.2.5 Выделение и очистка димерной формы rhBMP-2 47
2.2.6 Проверка биологической активности rhBMP-2 in vitro 48
2.2.7 Проверка остеопластических материалов на стерильность 49
2.2.8 Экспериментальные модели тестирования биологической активности остеоиндуктивных материалов in vivo 49
2.2.9 Компьютерно-томографическое исследование
2.2.10 Гистоморфологическое исследование 51
2.2.11 Конфокальная микроскопия 51
2.2.12 Статистический анализ и представление данных 52
3 Результаты и обсуждение 53
3.1 Получение остеоиндуктивных материалов на коллагеновом носителе с добавлением rhBMP-2 53
3.1.1 Получение ДКМ в виде различных по размеру фракций костной крошки 54
3.1.2 Получение малоинвазивных остеопластических материалов 55
3.1.3 Получение ДКМ в виде костных блоков 56
3.1.4 Иммобилизация rhBMP-2 на ДКМ 56
3.2 Тестирование остеопластических материалов на основе rhBMP-2 на экспериментальных моделях in vivo 57
3.2.1 Проверка активности крошки ДКМ с rhBMP-2 на модели индукции эктопического остеогенеза 57
3.2.2 Проверка активности малоинвазивных форм остеопластических материалов с rhBMP-2 в комбинации с титановыми имплантатами 61
3.2.3 Проверка активности остеоиндуктивных материалов в виде мембраны на модели создания краниальных дефектов критического размера 67
3.3 Создание штамма-продуцента химерного белка BMPRIA-CBD 80
3.3.1 Создание генно-инженерной конструкции 80
3.3.2 Трансформация штамма и индукция экспрессии белка 3.4 Оптимизация экспрессии BMPRIA-CBD в штамме-продуценте и условий его культивирования в ферментере 84
3.5 Разработка метода очистки димерной формы rhBMP-2 с помощью аффинного сорбента на основе BMPRIA-CBD
3.5.1 Выделение BMPRIA-CBD и получение целлюлозосодержащего сорбента на его основе 91
3.5.2 Сорбция димерной формы rhBMP-2 на целлюлозосодержащем сорбенте с BMPRIA-CBD 92
3.6 Проверка биологической активности выделенного rhBMP-2 in vitro 94
4 Выводы 99
Список сокращений 100
Список литературы 102
