Введение
I. Введение : 5
1.1. Объекты исследования 6
1.2. Цели и задачи работы 6
1.3. Основные реализованные в работе подходы 7
II. Обзор литературы 8
2.1. Введение 8
2.2. Классификация токсинов 10
2.3. Структурные особенности токсинов 12
2.4. Биосинтез полипептидных токсинов 16
2.5. Биологические свойства полипептидных токсинов
2.5.1. Токсины, действующие на К+ каналы 18
2.5.2. Токсины, действующие на Са2+ каналы 22
2.5.3. Токсины, воздействующие на Na+ каналы 26
2.5.4. Токсины, действующие на другие типы рецепторов 31
2.5.5. Токсины с неспецифичным действием
2.6. Современные подходы к исследованию токсинов пауков 34
2.7. Заключение 36
III. Материалы и методы исследования 38
3.1. Материалы 38
3.1.1. Реактивы 38
3.1.2. Биологический материал и животные 38
3.1.3. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы 38
3.2. Математические вычисления и данные для анализа 38
3.2.1. Исходные данные для анализа 38
3.2.2. Вычисления
3.3. Оборудование 40
3.4. Методы
3.4.1. Создание библиотек EST из ядовитых желез 41
3.4.2. Получение кДНК из пауков и морских анемон 41
3.4.3. Определение нуклеотидной последовательности генов, кодирующих токсины 42 3.4.4. Получение экспрессированных TRPV1 рецепторов в ооцитах X. /aevis 42
3.4.5. Разделение ядов на компоненты 43
3.4.6. Протеомные исследования 44
3.4.7. Определение аминокислотных последовательностей 44
3.4.8. Химический синтез пептидов из ядов пауков 44
3.4.9. Получение рекомбинантных токсинов морских анемон 45
3.4.10. Определение концентрации полипептидов 46
3.4.11. Определение констант ингибирования сериновых протеиназ 4б
3.4.12. Биологические испытания
3.4.12.1. Тестирование антимикробной активности 46
3.4.12.2. Тестирование гемолитической активности 47
3.4.12.3. Анализ инсектицидной активности 47
3.4.12.4. Анализ токсичности для млекопитающих 47
3.4.12.5. Измерение анальгетической активности 48
3.4.12.6. Электрофизиологические исследования 48
IV. Результаты и обсуждение 49
4.1. Разработка алгоритмов для анализа банков нуклеотидных
последовательностей 49
4.1.1. Ферменты, задействованные в созревании полипептидных молекул
4.1.2. Субтилизин-подобные пропротеин конвертазы 52
4.1.3. Изучение принципов созревания активных полипептидов из природных ядов пауков 53
4.1.4. Симметричные и регулярные мотивы ограниченного протеолиза 56
4.1.5. Анализ выборки препробелков из банка аминокислотных последовательностей 58
4.1.6. Алгоритм установления структуры зрелой цепи 63
4.1.7. Алгоритм поиска токсинов 64
4.2. Анализ баз данных 68
4.2.1. Создание баз данных нуклеотидных последовательностей 68
4.2.2. Разработка запросов для проведения анализа баз данных пауков69
4.2.3. Анализ базы данных EST последовательностей A. orienta/is
4.2.4. Анализ базы данных EST последовательностей L tarabaevi 75
4.2.5. Сравнение методов анализа банков нуклеотидных последовательностей (мотивы против контигов) 79
4.2.6. Разработка запросов для проведения анализа баз данных морских анемон 82
4.2.7. Анализ базы данных последовательностей морской анемоны A. viridis 86
4.3. Протеомный анализ ядов пауков 95
4.3.1. Компонентный анализ яда паука A. orientalis 95
4.3.2. Компонентный анализ яда паука L tarabaevi 101
4.4. Выделение инсекто-специфических токсинов 103
4.4.1. Инсектотоксины из яда паука S. florentina 103
4.4.2. Инсектотоксины из яда паука L tarabaevi 106
4.5. Поиск полипептидов с антимикробными свойствами 110
4.5.1. Выделение полипептидов из яда паука L tarabaevi 110
4.5.2. Особенности биосинтеза и строения антимикробных компонентов из яда паука L tarabaevi 113
4.6. Поиск селективных модуляторов TRPV1 рецептора 114
4.6.1. Актуальность проблемы поиска модуляторов TRPV1 и первичное тестирование ядов 114
4.6.2. Выделение полипептидных компонентов из яда морской анемоны И. crisp а 115
4.6.3. Биологическая активность новых токсинов из морских анемон 1 V. Выводы 124
VI. Список сокращений 125
VII. Благодарности 127
VIII. Список цитируемой литературы
