Введение
2. Обзор литературы 9
2.1. Пути биосинтеза предшественников изопреноидов 9
2.1.1.1. Ацетоацетил-CoA тиолаза 11
2.1.1.2. Гидрокси-3-метилглутарил-CoA синтаза 14
2.1.1.3. Гидрокси-3-метилглутарил-CoA редуктаза 18
2.1.1.4. Мевалонаткиназа 22
2.1.1.5. Фосфомевалонаткиназа 27
2.1.1.6. Мевалонатдифосфатдекарбоксилаза 32
2.1.1.7. Изопентенилфосфатизомераза 38
2.1.2. Метилэритритолфосфатный путь - основной путь биосинтеза изопреноидов у бактерий 43
2.2. Использование гетерологичного мевалонатного пути для продукции изопреноидов в Е. coli 45
2.3. Pantoea ananatis как бактерия с высоким биотехнологическим потенциалом 48
3. Материалы и методы 49
3.1 Бактериальные штаммы и плазмиды 49
3.2 Среды и условия культивирования штаммов 52
3.3. Генно-инженерные методики 52
3.3.1. Проведение полимеразной цепной реакции 53
3.3.2. Трансформация клеток P. ananatis плазмидной ДНК с помощью процедуры электропорации 53
3.3.3. Проведение интеграции хромосомы в штамм P.ananatis 54
3.3.4. Red-зависимая интеграция двухцепочечных фрагментов ДНК в хромосому 54
3.3.5. Излечивание клеток от плазмиды-помощника RSFRedTER 55
3.3.6. Излечивание клеток P. ananatis от термочувствительных плазмид-помощников pMW-nt/Xis-шґ, рАН123-шґ, рАН129-шґ 55
3.3.7. Интеграция в хромосому P. ananatis с помощью метода «Dual In/Out» 55
3.3.8. Конструирование точек интеграции в хромосоме P. ananatis 56
3.3.9. Интеграция CRIM плазмид, рАН162- в сайт аПВщ в хромосоме P. ananatis 60
3.3.10. Выщепление плазмидной части 60
3.4. Конструирование штаммов и плазмид 61
3.4.1. Конструирование плазмид 61
3.4.1.1. Клонирование генов mvkmpd, mvkmcl и mvksce, mvkmma на pET векторы 61
3.4.1.2. Конструирование плазмиды pAH162-Ptac 62
3.4.1.3. Клонирование генов mvkmpd, mvkmma, mvkmcl, mvknmr и mvksce на интегративный вектор 62
3.4.2 Конструирование штаммов 64
3.4.2.1. Конструирование штаммов ISP3.2-mvk(X) 64
3.4.2.2.Консруирование штамма IR5-3 66
3.4.2.3. Конструирование набора штаммов интеграцией смеси плазмид pAH162-PphoC-mvaES, pAH162-Ptac-mvk и pAH162-Ptac-KDyI в IR5-3-S 67
3.5. Ферментация штаммов 68
3.5.1. Ферментация штаммов ISP3-mvk(X) содержащих многокопийную плазмиду с изопренсинтазой 68
3.5.2. Ферментация штаммов производных IR5-3 в виалах для газовой хроматографии, содержащих многокопийную плазмиду с изопренсинтазой 69
3.5.3. Измерение концентрации изопрена 69
3.6 Экспрессия и очистка рекомбинантных белков 70
3.6.1. Экспрессия и предварительный анализ активности мевалонаткиназ 70
3.6.2. Экспрессия и очистка рекомбинантных мевалонаткиназ из M. concilii, M. paludicola, M. mazei, N. maritimus и S. cerevisiae 71
3.6.3. Приготовление PMK 71
3.6.4. Определение кинетических параметров ферментов и ингибирование DMAPP, GPP, FPP и DPM. 72
4. Результаты и их обсуждение 74
4.1. Новые мевалонаткиназы и их характеристика 74
4.1.1. Выбор генов, предположительно кодирующих устойчивые к ретро-ингибированию мевалонаткиназы 74
4.1.2. Клонирование генов мевалонаткиназ из M. concilii, M. paludicola, M. mazei, N. maritimus и S. cerevisiae их экспрессия в E. coli и очистка соответствующих рекомбинантных белков. 77
4.1.3. Определение кинетических параметров MVKMma, MVKMpd, MVKMma , MVKNmr и MVKSce 79
4.1.4. Превращение мевалоната в фосфо- и дифосфомевалонат in vitro в присутствии очищенной мевалонаткиназы и фосфомевалонаткиназы из S. cerevisiae. 83
4.1.5. Проверка ингибирования различных мевалонаткиназ интермедиатами мевалонатного пути, GPP и FPP 85
4.1.6. Анализ генетического окружения генов mvk 86
4.1.7. Анализ структурных особенностей устойчивых к ретроингибированию мевалонаткиназ 88
4.1.8. Сопоставление продукции изопрена изогенными штаммами с разными мевалонаткиназами 90
4.2. Обеспечение баланса биосинтетических активностей в штамме, продуцирующем DMAPP, при введении дополнительных копий генов мевалонатного пути. 93
4.2.1. Конструирование базового штамма для одновременной интеграции нескольких экспрессионных кассет 95
4.2.1.1. Необходимость модификации метода Dual In/Out 96
4.2.1.2. Использование модифицированного метода Dual In/Out для конструирования штамма IR5-3 98
4.2.1.4. Предварительное определение лимитирующей активности MVA пути в модельном штамме 101
4.2.1.5. Получение набора штаммов, содержащих дополнительные копии генов MVA пути, за один раунд интеграции 102
4.2.2. Отбор клонов с оптимальным сочетанием числа копий генов MVA пути с увеличенной продукцией изопрена 104
Выводы 106
Список сокращений и условных обозначений 107
Список цитируемой литературы 109
Благодарности 134
Приложение 135
