Введение
3. Литературный обзор
3.1. Общая характеристика факторов роста
3.2. Основной фактор роста фибробластов FGF-2
3.2.1. Общая характеристика FGF-2
3.2.2. Взаимодействие FGF-2 с рецепторами
3.2.3. Изоформы FGF-2
3.2.4. Структура FGF-2
3.2.5. Биологическая активность и функции FGF-2
3.3. Трансформирующий фактор роста pi (TGF-pl) и его рецептор типа II (ТріШ)
3.3.1. Суперсемейство белков TGF-P1
3.3.2. Структура TGF-pl
3.3.3. Рецепторы и механизмы внутриклеточных сигнальных путей TGF-P
3.3.4. Биологическая активность и функции TGF-pl
3.4. Экспрессия и ренатурация рекомбинантных белков
3.4.1. Слитные рекомбинантные белки
3.4.2. Экспрессия рекомбинантных белков
3.4.3. Расщепление слитных белков
3.4.4. Ренатурация рекомбинантных белков
4. Материалы и методы
4.1. Материалы
4.2. Методы
4.2.1. Конструирование плазмидной ДНК
4.2.2. Сайт-направленный мутагенез
4.2.3. PIPES-трансформация, приготовление компетентных клеток Е.соН штамма XL-1 Blue
4.2.4. Получение компетентных клеток Е.соН BL21(DE3)
4.2.5. Трансформация клеток Е.соН плазмидной ДНК
4.2.6. Выделение плазмидной ДНК
4.2.7. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле
4.2.8. Определение концентрации белка в растворе
4.2.9. Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном геле
4.2.10. Экспрессия белка FGF-2 и его мутантного варианта и белка TJ3RII
4.2.11. Очистка и расщепление белка FGF-2
4.2.12. Идентификация белков по N-концевой последовательности
4.2.13. Метод оценки жизнеспособности клеток с метилтиазолтетразолием (МТТ-тест)
4.2.14. Очистка, ренатурация и расщепление белка TpRII-ED
4.2.15. Очистка TpRII-ED с помощью метода обратнофазной HPLC хроматографии
4.2.16. MALDI-TOF масс-спектрометрия
4.2.17. Метод спектроскопии кругового дихроизма
4.2.18. !Н ЯМР-спектроскопия
4.2.19. Исследование связывания белка-рецептора TpRII-ED с лигандом TGF-J31 методом ELISA
5. Результаты и обсуждение
5.1. Синтез генов FGF-2 и TPRII-ED и клонирование их в экспрессионные векторы
5.2. Экспрессия слитного белка Trx/FGF2 в Е.соН
5.3. Очистка слитного белка Trx/FGF-2
5.4. Расщепление слитного белка Trx/FGF-2 энтеропептидазой и очистка целевого белка FGF-2
5.5. Исследование физико-химических свойств полученного рекомбинантного белка FGF-2
5.6. Введение C78S и C96S мутаций в ген FGF-2 и получение экспрессирующего вектора pET32a/FGF-2/C78S/C96S
5.7. Экспрессия и очистка мутантного варианта FGF-2/C78S/C96S
5.8. Проверка биологической активности очищенного препарата FGF-2 и его мутантного варианта FGF-2/C78S/C96S на культуре клеток
5.9. Преимущества разработанной методики получения и очистки рекомбинантного FGF-2
5.10. Экспрессия слитного белка Trx/TpRII-ED в E.coli
5.11. Очистка и расщепление слитного белка Trx/TpRII-ED энтеропептидазой и очистка целевого белка TpRII-ED
5.12. Исследование физико-химических свойств полученного рекомбинантного белка TpRII-ED
5.13. Исследование связывания белка-рецептора TpRII-ED с лигандом TGF-pl методом ELISA
5.14. Преимущества разработанной методики получения и очистки рекомбинантного белка-рецептора TpRII-ED
6. Выводы
7. Список литературы
