Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Проблема восстановления потенциала дифференцированной клетки 11
1.2. Изучение репрограммирования генома соматических клеток с помощью переноса соматических ядер 12
1.3. Изучение репрограммирования генома соматических клеток с помощью их слияния с эмбриональными стволовыми клетками 16
1.3.1. Классификация клеток обладающих высоким потенциалом 16
1.3.2. Получение, поддержание и дифференцировка ЭСК 18
1.3.3. Применение ЭСК для изучения генетической регуляции развития и направленного мутагенеза 21
1.3.4. Клеточные гибриды между ЭСК и соматическими клетками 23
1.4. Методы оценки плюрипотентности ЭСК и гибридных клеток 29
1.4.1. Гисто- и иммуногистохимические маркеры 29
1.4.2. Анализ экспрессии генов-маркеров плюрипотентности 32
1.4.3. Оценка плюрипотентности клеток в тестах in vivo - получение химерных животных 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы 39
2.1. Клетки и клеточные линии 39
2.2. Культивирование клеток в монослое 39
2.3. Замораживание клеток 40
2.4. Размораживание клеток 40
2.5. Гистохимическое выявление щелочной фосфатазы 40
2.6. Оценка активности щелочной фосфатазы 41
2.7. Иммуногистохимическое выявление экспрессии ЕСМА7 41
2.8. Получение химерных животных 42
2.9. Получение эмбриоидных телец in vitro 42
2.10. Биохимическое выявление глюкозофосфатизомеразы (ГФИ) 42
2.11. Выделение ДНК 43
2.12. Выделение РНК 44
2.13. Синтез кДНК 44
2.14. ПЦР-анализ 45
2.15. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле 45
2.16. Рестрикционный анализ 46
ГЛАВА 3. Результаты 47
3.1. Гистохимический анализ активности щелочной фосфатазы в гибридных клетках серии НМС 47
3.2. Иммуногистохимический анализ эмбрионального антигена ЕСМА7 в гибридных клетках 50
3.3. Оценка плюрипотентности гибридных клеток в тесте на химеризм 50
3.4. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в гибридных клетках 57
3.5. Сравнение экспрессии родительских аллелей генов Oct4, Nanog и Gla в гибридных клетках 59
3.6. Инактивация Х-хромосомы при индуцированной in vitro дифференцировке гибридных клеток 62
ГЛАВА 4. Обсуждение 67
Выводы 79
Список литературы
