Введение
Глава 1 Обзор литературы 23
1.1 Окситоцин: синтез и высвобождение 23
1.2 Влияние окситоцина на поведение человека и животных 24
1.3 Вовлечение окситоциновых рецепторов во внутриклеточные каскады 30
1.4 Участие бифункционального рецептора-энзима CD38/АДФ-рибозилциклазы в высвобождении окситоцина из нервных клеток 32
1.5 Центральная ауторегуляция ОХТ при реализации социального поведения: молекулярные механизмы 35
1.6 Влияние социального опыта на обмен окситоцина 41
1.7 TRPM2, цАДФ-рибоза и осциляции внутриклеточного кальция в сигнализации окситоцина в клетках нейрональной природы 44
1.8 CD157/BST-1 - гомолога бифункционального рецептора-энзима CD38/АДФ-рибозилциклазы - во внутриклеточной сигнализации 47
Глава 2 Объекты и методы исследования 51
2.1 Объекты исследования 52
2.1.1 Мыши, дефицитные по гену Cd38 (Cd38-/--) Cd38-/--- экспериментальная группа мышей (генетический фон - линия ICR) 56
2.1.2 Мыши, дефицитные по Cd157/Bst1 (Cd157-/-). 57
2.1.3 Фармакологические модели болезни Паркинсона (БП). 58
2.1.4 Мыши с экспериментальной нейродегенерацией (болезнь Альцгеймера) 59
2.1.5 Мыши с локальным нокдауном по CD38 и TRPM2 59
2.1.6 Культуры клеток 60
2.2 Тесты поведенческого фенотипирования животных 60
2.2.1 Поведенческие тесты для мышей в раннем постанатальном периоде 61
2.2.2 Поведенческие тесты для половозрелых мышей 61
2.3 Регистрация и анализ USV 67
2.4 Забор крови, спинномозговой жидкости и тканей головного мозга 68
2.5 Определение уровня окситоцина 69
2.6 Активность АДФ-рибозилциклазы 69
2.7 Введение экзогенного окситоцина 70
2.8 Антитела против CD157 кролика 70
2.9 Измерение температуры тела мышей 71
2.10 ПЦР-анализ 71
2.11 Иммуногистохимия 73
2.12 Плазмиды и трансфекция 76
2.13 Оценка синтеза NAADP 76
2.14 Высвобождение OХT из гипоталамуса 77
2.15 Микроперфузия головного мозга мыши 78
2.16 Эксперименты in vitro 79
2.16.1 Иcпользуемые материалы 79
2.16.2 ОТ-ПЦР для экспериментов in vitro 80
2.16.3 Измерение осцилляций [Ca2+]i 80
2.16.4 Клонирование и трансфекция кДНК окситоциновых рецепторов человека 81
2.17 Статистическая обработка результатов 82
Глава 3 Результаты исследований 83
3.1 Особенности нейроповеденческого статуса у взрослых мышей с делецией гена CD157/BST1 83
3.1.1 Общее состояние и локомоторная активность 83
3.1.2 Поведение во время экспозиции нового 86
3.1.3 Тревожное поведение и его коррекция 95
3.1.4 Депресивно-подобное поведение и его коррекция 99
3.1.5 Социализация в трехкамерном тесте 101
3.1.6 Эмоциональные ответы Cd157-/- мышей в тестах «Fear-conditioning» и «Startle response» 105
3.1.7 Коррекция пониженного уровня социализации с помощью экзогенного окситоцина 107
3.2 Экспрессия CD157 в различные периоды онтогенеза 109
3.2.1 Экспрессия CD157 в различных областях головного мозга у половзреллых Cd157+/+ мышей и мышей с делецией гена Cd157 109
3.2.2 Наличие CD157 в стволовых клетках мозга 116
3.3. Ферментативная активность CD157 116
3.4 Активность АДФ-рибозилциклазы 121
3.4.1 Активность АДФ-рибозилциклазы и уровень окситоцина в плазме крови у половозрелых мышей с делецией гена Cd157 121
3.4.2 Экспрессия мРНК у новорожденных и взрослых самцов мышей 122
3.5 CD38 и CD157 в процессах нейрогенеза 122
3.5.1 CD38 и CD157 в процессах нейрогенеза 124
3.5.2 CD38 и CD157 в процессах синаптогенеза 125
3.5.3. Особенности экспрессии CD38 и CD157 в клетках астроглиальной природы при экспериментальной нейродегенерации 127
3.6 Особенности развития и ультразвуковой коммуникации в период грудного вскармливания у Cd157 нокаутных мышей 130
3.6.1 Результаты теста «Открытое поле» в экспериментальной модели аутизма 130
3.6.2 Групповая активность мышей самцов в «открытом поле» 130
3.6.3 Ультразвуковая вокализация мышей самцов при социальной изоляции в раннем постнатальном периоде 134
3.6.4 Фармакологическая коррекция дефицита ультразвуковой вокализации 138
3.6.5 Ультразвуковая вокализация мышей самцов Cd157+/- при социальной изоляции в раннем постнатальном периоде 142
3.6.6 Контекст-специфичная (в процессе ухаживания самца за самкой) ультразвуковая вокализация у взрослых Cd157+/+ и Cd157-/- мышей 142
3.6.7 Активность АДФ-рибозилциклазы в тканях головного мозга и уровень ОХТ в плазме крови Cd157+/+ и Cd157-/- мышей-самцов в первые десять дней постнатального развития 145
3.7 Особенности развития и ультразвуковой коммуникации в период грудного вскармливания у Cd38 нокаутных мышей 151
3.7.1 Локомоторная активность и ультразвуковая вокализация у Cd38-/- мышей (модель экспериментального аутизма) 152
3.7.2 Уровень ОХТ в плазме крови и активность АДФ-рибозилциклазы в тканях гловного мозга у Cd38-/- мышей (модель экспериментального аутизма) 154
3.8 Осцилляции внутриклеточного кальция, индуцированные внеклеточным применением цAДФ-рибозой или окситоцином в нейрональных клетках грызунов NG108-15 157
3.8.1 Температура-чувствительное возрастание внутриклеточного кальция индуцируемое аппликациями цАДФ-рибозы или окситоцина в нейрональных клетках грызунов NG108-15 157
3.8.2 Ингибирование путем удаления внеклеточного кальция и TRPM2 антагонистом 158
3.8.3 Увеличение ингибирования [Ca2+]i с помощью 8-bromo-cADPR 163
3.8.4 Окситоцин-индуцируемое повышение содержания кальция в клетках NG108-15, экспрессирующие рецепторы к окситоцину 165
3.9 Циклическая АДФ-рибоза и повышенная температура регулируют высвобождение окситоцина через CD38 и TRPM2 в гипоталамусе мышей при социальном или психологическом стрессе 168
3.9.1 Высвобождение ОХТ стимулируется циклической АДФ-рибозой и нагреванием in vitro 170
3.9.2 Высвобождение гипоталамического ОХТ у мышей с локальным нокдауном по CD38 или TRPM2 in vitro 173
3.9.3 Высвобождение OХT in vitro у социально стрессированных мышей 174
3.9.4 Высвобождение OХT in vivo при перфузии головного мозга с помощью цАДФ-рибозы у доминантных или подчиненных мышей 177
3.9.5 Высвобождение OХT in vivo при перфузии головного мозга с помощью cADPR у мышей доминантной и подчиненной группы 178
3.9.6 Высвобождение OХT in vivo при гипертермия у мышей - эффекты воздействии открытого поля 179
3.9.7 Уровень OХT в CSF во время гипертермии у мышей с инъекцией липополисахарида (LPS) 182
3.9.8 Механизмы стимулирующего высвобождения OХT на уровнях мРНК и белков CD38 и TRPM2 185
Глава 4 Обсуждение полученных результатов 190
4.1 Циклическая ADP-рибоза-, TRPM2- и ОХТ-зависимые осцилляции внутриклеточного кальция в клетках нейрональной природы грызунов in vitro 191
4.2 Концентрация ОХТ в CSF и стресс 194
4.3 Социальные нарушения, гипертермия и аутизм 197
4.4 Тревожное и депрессивное поведение у взрослых мышей с делецией гена CD157/BST1 (фактор риска болезни Паркинсона) 198
4.5 Нарушение ультразвуковой коммуникации в период грудного вскармливания у Cd157 нокаутных мышей: временная коррекция окситоцином 206
4.6 CD157/BST-1 - нейрорегулятор 208
4.7 Эффекты делеции гена Cd38 на процессы развития в ювенильном периоде у мышей-самцов. Роль экзогенного окситоцина 213
Заключение 216
Выводы 219
Практические рекомендации 221
Список литературы 224
Приложения 264
