Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Специфическая профилактика бруцеллеза сельскохозяйственных животных 11
1.2. Методы определения количества жизнеспособных бактерий 15
1.2.1. Прямые методы анализа жизнеспособности микробной культуры 16
1.2.2. Косвенные методы определения количества жизнеспособных микробных клеток 18
1.2.2.1. Определение количества жизнеспособных микробных клеток биолюминесцентным методом при помощи люцифе-рин-люциферазной системы светляков 22
1.2.2.2. Применение люциферазы светляков для решения биоаналитических задач 23
1.2.2.3. Методология биолюминесцентного определения количества микробных клеток 25
1.2.2.4. Подготовка образцов для определения АТФ 25
1.2.2.5. Методы экстракции внутриклеточного АТФ 25
1.2.2.6. Применение АТФ-метрии для контроля качества лиофили-зированных вакцин 28
ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 31
2.1. Материалы и методы 31
2.2. Методики проведения экспериментов 33
2.2.1. Определение оптической концентрации бактерий 33
2.2.2. Определение количества живых бактерий чашечным методом 34
2.2.3 Измерение концентрации АТФ в бактериальных суспензиях биолюминесцентным методом 34
2.2.3.1. Приготовление растворов и экстрактов АТФ 34
2.2.3.2. Измерение биолюминесцентного сигнала 36
2.2.3.3. Расчет концентрации АТФ 36
2.2.3.4. Расчет количества жизнеспособных клеток по результатам биолюминесцентных измерений 37
2.2.3.5. Статистическая обработка результатов 37
2.3. Результаты собственных исследований 39
2.3.1. Влияние внеклеточного АТФ в образцах вакцины на интенсивность сигнала биолюминесценции 39
2.3.2 Калибровка АТФ-реагента при использовании стандартных АТФ-растворов 42
2.3.3. Определение оптимальных объемов реакционной смеси (реагент-испытуемый образец) 43
2.3.4. Изучение экстрагирующих свойств неонола-10 и влияния продолжительности экспозиции образца в экстрагенте на интенсивность биолюминесцентного сигнала 44
2.3.5. Определение возможности получения экстрактов лиофи-лизированной культуры бруцелл в ДМСО
2.3.6. Влияние длительности инкубирования водной суспензии бруцелл после восстановления лиофилизированной культуры на концентрацию АТФ 46
7. Определение количества жизнеспособных клеток в лиофилизированных вакцинах Brucella abortus 47
8. Биолюминесцентное определение количества жизнеспособных бруцелл в лиофилизированных бруцеллезных вакцинах на разных сроках хранения 55
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 58
ВЫВОДЫ 64
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 65
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 66
ПРИЛОЖЕНИЯ 91
