Введение
Глава 1 Дендритные клетки (ДК) и их роль в противоопухолевом иммунитете (обзор литературы) 10
1.1. Фенотипическая и функциональная гетерогенность ДК 10
1.2. Миелоидные ДК: иммунофенотип и функциональная активность 12
1.3. Миелоидные ДК и противоопухолевый иммунный ответ 14
1.4. Миелоидные ДК и противоопухолевая вакцинотерапия 16
1.5. Требования надлежащей лабораторной практики (GLP) в получении противоопухолевых дендритноклеточных вакцин 16
Глава 2 Материалы и методы исследования 25
2.1. Материалы 25
2.2. Методы 30
2.2.1. Получение костномозговых и периферических дендритных клеток 34
2.2.2. Дифференцировка дендритных клеток из миелоидных предшественников ex vivo 35
2.2.3. Приготовление опухолевого лизата, содержащего раково-тестикулярные антигены 39
2.2.4. Криоконсервация миелоидных предшественников и вакцинных дендритных клеток 40
2.2.5. Размораживание миелоидных предшественников и вакцинных дендритных клеток .40
2.2.6. Оценка количества и жизнеспособности (миелоидных предшественников, вакцинных дендритных клеток, мононуклеаров, опухолевых клеток) 40
2.2.7. Иммуноцитохимическая характеристика дендритных клеток 42
2.2.8. Иммунофенотипический анализ миелоидных предшественников, вакцинных дендритных клеток, опухолевых клеток 42
2.2.9. Мониторинг специфического поствакцинального иммунного ответа (ELISpot анализ) 44
2.2.10. Оценка поствакцинального гуморального иммунного ответа 46
(клеточный ИФА) 46
Глава 3 Стандартизация методов получения и криоконсервации миелоидных предшественников ДК из лейкаферезного материала и периферической крови 49
3.1. Стандартизация оптимальных условий выделения МНК и моноцитов из лейкаферезного материала и периферической крови 49
3.2. Стандартизация оптимальных условий криоконсервации МНК и моноцитов из лейкаферезного материала и периферической крови 53
Глава 4 Оптимизация и стандартизация условий дифференцировки вакцинных ДК 58
4.1. Изучение влияния ростового фактора GM-CSF импортного (GM-CSF1) и отечественного (GM-CSF2) производства на дифференцировку ДК in vitro 58
4.2. Изучение влияния различных концентраций IL-4 на дифференцировку ДК in vitro 61
4.3. Изучение влияния IFN- на дифференцировку ДК in vitro 63
4.4. Изучение влияния питательных сред на дифференцировку и созревание ДК 65
4.4.1. Оценка иммунофенотипа ДК, дифференцированных на различных питательных средах: контроль качества 65
Глава 5 Оптимизация и стандартизация условий нагрузки и активации ДК 70
5.1. Характеристика клеточных линий меланомы кожи человека, экспрессирующих РТА 70
5.2. Нагрузка и активация незрелых CD14-CD1a+CD83- ДК 75
5.3. Оценка дифференцировки ДК по уровню экспрессии иммунофенотипических маркеров на разных стадиях созревания ДК 76
Глава 6 Стандартизация условий криоконсервации и хранения вакцинных ДК в соответствии c иммунофенотипом, требованиями надлежащей лабораторной и клинической практики 80
6.1. Оценка жизнеспособности ДК до и после криоконсервации в ультранизких температурах 80
6.2. Продолжительное хранение криоконсервированной дендритноклеточной вакцины: контроль качества 82
6.3. Оценка возможности использования бессывороточной среды для криоконсервации и хранения ДК 85
6.4. Оценка функциональной активности криоконсервированных вакцинных ДК 86
6.5. Скрининг вакцинного препарата ДК на наличие инфекционных агентов: контроль качества 88
6.6. Организация лаборатории длительного хранения криоконсервированных дендритноклеточных вакцин (криогенная лаборатория) 90
Глава 7 Активная специфическая иммунотерапия (вакцинотерапия) аутологичными костномозговыми и периферическими ДК больных диссеминированной меланомой кожи 93
7.1. Оценка безопасности вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками 93
7.2. Оценка клинической эффективности вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками 94
7.3. Оценка иммунологической эффективности терапии 97
7.3.1. Оценка реакций ГЗТ у больных на фоне терапии ДКВ 98
7.3.2. Оценка содержания субпопуляций лимфоцитов у больных, получавших лечение аутологичными ДК 99
7.3.3. Оценка специфического иммунного ответа 101
Глава 8 Обсуждение результатов исследования 105
Выводы 117
Литература 119
Приложения 134
