Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Основные понятия и термины, относящиеся к холодовому стрессу 11
1.2 Повреждения растений от действия холодового стрессора 13
1.2.1 Возможные причины развития окислительного стресса и перекисного окисления липидов у растений при низких положительных температурах 16
1.3 Адаптация растений к действию низких температур 20
1.3.1 Роль липидов (ПНЖК и десатураз) в низкотемпературной адаптации растений 20
1.3.2 Роль сахаров в низкотемпературной адаптации растений 24
1.3.3 Роль антиоксидантных ферментов в адаптации растений 27
1.4 Применение достижений генетической инженерии в исследованиях холодоустойчивости растений 35
2 Объект и методы исследования 39
2.1 Объект исследования 39
2.2 Культивирование растений 41
2.3 Закаливание и холодовая обработка для определения устойчивости растений картофеля 41
2.4 Доказательства наличия и экспрессии гетерологичного гена desA 12-ацил-липидной десатуразы у растений картофеля 42
2.4.1 Выделение тотальной растительной ДНК 42
2.4.2 Проведение полимеразной цепной реакции 43
2.4.3 Электрофорез ДНК в агарозном геле 45
2.4.4 Выделение тотальной растительной РНК 45
2.4.5 Проведение обратной транскрипции 46
2.5 Определение содержания липидов и их жирнокислотного состава 47
2.6 Электрономикроскопическое и морфометрическое исследование ультраструктуры хлоропластов 48
2.7 Измерение показателей интенсивности окислительного стресса 49
2.7.1 Определение содержания пероксида водорода 49
2.7.2 Определение интенсивности ПОЛ по содержанию конъюгированных диенов жирных кислот 49
2.7.3 Определение интенсивности ПОЛ по содержанию МДА 50
2.8 Определение устойчивости растений по выходу электролитов 51
2.9 Исследование активности антиоксидантных ферментов 51
2.9.1 Выделение растворимого белка из листьев растений 51
2.9.2 Определение изоферментного состава СОД и каталазы с помощью нативного электрофореза 52
2.9.3 Ингибиторный анализ типов СОД 54
2.9.4 Определение общей активности СОД 54
2.9.5 Определение общей активности каталазы 55
2.9.6 Определение активности растворимых пероксидаз гваякола 55
2.9.7 Определение активности пероксидазы аскорбата 56
2.10 Определение различных форм сахаров в листьях растений 56
2.10.1 Определение содержания глюкозы 56
2.10.2 Определение содержания сахарозы и фруктозы 57
2.11 Статистическая обработка данных 58
3 Результаты и их обсуждение 59
3.1 Молекулярный и биологический анализ растений картофеля, трансформированных геном desA 12-ацил-липидной десатуразы цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 59
3.1.1 Определение наличия гена desA с помощью ПЦР и уровня экспрессии гена с помощью ПЦР после обратной транскрипции 59
3.1.2 Изменение содержания и количественного состава ЖК мембранных липидов в листьях картофеля под влиянием трансформации геном desA 12-ацил-липидной десатуразы 60
3.1.3 Определение конститутивной устойчивости контрольных и desA-licBM3 растений картофеля к действию гипотермии 63
3.2 Индуцируемые низкой закаливающей температурой изменения устойчивости контрольных и desA-licBM3 растений картофеля к гипотермии 64
3.3 Изучение изменений основных процессов, участвующих в закаливании холодостойких растений картофеля к гипотермии, и влияние на них активности введенного гена desA 12-ацил-липидной десатуразы 67
3.3.1 Изменения в содержании и жирнокислотном составе мембранных липидов в листьях контрольных и desA-licBM3 растений при закаливании 68
3.3.2 Изменения ультраструктурной организации хлоропластов в процессе закаливания контрольных и desA-licBM3 растений 71
3.3.3 Изменения содержания растворимых углеводов у контрольных и desA-licBM3 растений в процессе закаливания 76
3.3.4 Изменение показателей интенсивности окислительных процессов при закаливании контрольных и desA-licBM3 растений картофеля 79
3.3.4.1 Изменения содержания пероксида водорода и показателей ПОЛ у контрольных и desA-licBM3 растений 81
3.3.5 Изменение активности антиоксидантных ферментов у контрольных иdesA-licBM3 растений картофеля при закаливании 83
3.3.5.1 Анализ изменений общей активности СОД ее типов и изоферментов у контрольных и desA-licBM3 растений картофеля при закаливании 84
3.3.5.2 Изменения общей активности каталазы и ее изоферментов в листьях контрольных и desA-licBM3 растений 91
3.3.5.3 Анализ изменений активности растворимых гваяколовых пероксидаз в листьях контрольных и desA-licBM3 растений 95
3.3.5.4 Анализ изменений пероксидазы аскорбата в листьях контрольных и desA-licBM3 растений картофеля 97
Заключение 99
Выводы 102
Список использованной литературы
