Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Бактериальные аспарагиназы и их свойства 11
1.1.1. Распространение и противоопухолевая активность 11
1.1.2. Механизм ферментативной реакции 14
1.1.3. Физико-химическая характеристика бактериальных L-аспарагиназ 18
1.1.4. Свойства терапевтически значимых L-аспарагиназ 22
1.2. Бактериальные аспарагиназы как противоопухолевые препараты, проблемы и перспективы их применения 25
1.3. Модификация белков полиэтилен гликолем 28
1.3.1. Пегилирование и его преимущества 28
1.3.2.Структура и свойства полиэтилен гликоля 29
1.3.3. Биохимия пегилирования 31
1.3.4. Производные полиэтиленгликоля, применяемые для модификации белков 34
1.3.5. Влияние пегилирования на фармакокинетические и фармакодинамические свойства белка 40
2. Материалы и методы 44
2.1. Экспрессия рекомбинантной L-аспарагиназы и ее выделение 44
2.1.1. Культивирование штамм а-продуцента и экспрессия фермента 44
2.1.2. Очистка и выделение L-аспарагиназы 45
2.2. Физико-химическая и кинетическая характеристика белка 47
2.2.1 .Электрофорез в ПААГ/ДСН геле 47
2.2.2. Изоэлектрофокусирование 47
2.2.3. Определение аспарагиназной активности 47
2.2.4.0пределение концентрации белка 48
2.2.5. Определение кинетических параметров аспарагиназы 48
2.3. Модификация аспарагиназы производными полиэтиленгликоля 49
2,3.1.Модификация белка 2,4-бис (о-метоксиполиэтиленгликоль) -б-хлор-э-триазином 49
2.3.2. Модификация аспарагиназы метоксиполиэтиленгликоль-п-нитрофенилкарбонатом 50
2.3.3. Масс-сп ектрометри чес кий анализ 50
2.4. Определение цитотоксическои активности аспарагиназы in vitro 51
2.5. Определение иммуногенности аспарагиназы 52
2.5.1. Получение специфических поликлональных антител 52
2.5.2. Определение уровня выработки антител методом прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) 52
3.Результаты и обсуждение 54
3.1. Получение препарата рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora 54
3.2. Подбор модифицирующего реагента 58
3.2.1. Получение 2,4-бис (О-метоксиполиэтиленгликоль) -б-хлор-Б-триазина 58
3.2.2. Получение метоксиполиэтиленгликоль- п-нитрофенилкарбоната 61
3.3. Получение пегилированнои рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora и оптимизация процесса модификации 62
3.4. Физико-химическая и кинетическая характеристика модифицированной L-аспарагиназы Erwinia carotovora 71
3.5. Стабильность модифицированного фермента 77
3.7. Оценка цитотоксической активности ПЭГ-аспарагиназы in vitro 83
3.6. Характеристика иммуногенности пегилированнои L-аспарагиназы Erwinia carotovora 87
4. Выводы 89
5.Литература 90
