Введение
Глава 1. Обзор литературы. 6
1.1. Анабиоз как явление природы. 6
1.2. Стресс у бактерий и реакция на него. 7
1.2.1. Выживание бактерий в процессе длительного голодания. 9
1.2.2. Стационарная фаза развития культуры. 10
1.2.3. Факторы, определяющие поведение бактериальной популяции в условиях недостатка питательных веществ. 11
1.2.4. Биохимические изменения бактериальной клетки в условиях голодания . 12
1.2.5. Генетическая регуляция переживания бактериальными клетками неблагоприятных
условий. 16
1.3. Покоящиеся формы неспорулирующих бактерий. 19
1.41 Выход бактерий из покоящегося состояния. 22
1.5. Социальное поведение бактерий. 29
1.6. Туберкулез и латентность инфекции. 30
1.6.1. Получение латентных форм Mycobacterium tuberculosis на экспериментальных животных . 31
1.6.2. Модели покоящихся форм М. tuberculosis in vitro. 33
Глава 2. Материалы и методы 35
2.1. Выращивание бактериальных культур 35
2.2. Оценка жизнеспособности клеток. 36
2.3.Определение общего числа клеток (ОЧК) 36
2.4. Получение супернатантов для восстановления «некультивируемых» форм. 36
2:5. Получение рекомбинантного фактора Rpf. 36
2.6. Аффинная хроматография с использованием антител. 37
2.7. Реактивация «некультивируемых» форм. 38
2.8. Измерение численного распределения клеток. 38
2.9. Флуоресцентная микроскопия. 39
2.10. Сканирующая электронная микроскопия. 39
2.11. Измерение окислительно-восстановительного потенциала. 39
2.12. Трансформация культуры М. smegmatis. 40
2.13. Процедура со-культивирования. 40
2.14. Иммуноферментный анализ. 40
2.15. Получение СН, обладающего ингибиторным действием на рост клеток. 40
2.16. Тестирование активности ингибирующих супернатантов. 41
2.17. Гель - фильтрация СН с ингибирующей активностью. 41
2.18. Ультрафильтрация СН с ингибирующей активностью. 41
2.19. Гидрофобная хроматография. 41
2.20. Тонкослойная хроматография (ТСХ). 42
2.21. Получение фракции липидов из супернатанта с ингибирующей активностью. 42
2.22. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР). 42
2.23. Инфракрасная спектроскопия ингибирующего вещества (ИВ). 42
2.24. Включение радиоактивной метки. 43
2.25. Хромато-масс-спектроскопия. 43
Глава 3. Результаты. 45
3.1. Получение «некультивируемых» форм микроорганизмов семейства Nocardiaceae.—45
3.1.1. Поведение культуры Rhodococcus rhodochrous в условиях недостатка питательных. веществ . 45
3.1.2. Образование «некультивируемых» форм культурой Mycobacterium smegmatis, как результат действия многих факторов. 48
3.1.3. Формирование покоящихся клеток культурой Mycobacterium tuberculosis при длительном инкубировании в стационарной фазе. 51
3.1.4. Микроскопия клеток, проявляющих способность образовывать покоящиеся формы. 53
3.1.5. Образование «некультивируемых» форм у мутантных клеток М.smegmatis . 56
3.2. Изучение вещества, накапливающееся в культуральной жидкости бактерий при переходе в «некультивируемое» состояние. 59
3.2.1. Тестирование активности и физико-биологические характеристики ИВ. 60
3.2.2. Метод очистки. 64
3.2.3. Исследование структуры. 65
3.3. Восстановление покоящихся форм. 82
3.3.1. Разработка процедуры реактивации «некультивируемых» клеток. 82
3.3.2. Биохимический анализ супернатантов, проявляющих активирующую активность. 92
3.3.3; Исследование трансформантов М. smegmatis, содержащих плазмиду со встроенным
белком Rpf. 94
Глава 4. Обсуждение, 98
Выводы 105
Список литературы 106
