Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Влияние засоления на растения 9
1.2. Механизмы адаптации растений к засолению 12
1.2.1.Восприятие сигнала повышенной концентрации Na 12
1.2.2.Осмотическая регуляция 14
1.2.3.Поддержание ионного гомеостаза 15
1.3. Поступление Na в растение и его транспортеры 15
1.3.1.Ионные каналы 17
1.3.2.Поступление Na+ через апопласт 18
1.3.3.Транспортеры группы НКТ 18
1.3.4.Транспортеры группы СНХ 19
1.4. Группа NHX- антипортеры 19
1.4.1.Филогенетический анализ 20
1.4.2.NHX - антипортеры плазматической мембраны 21
1.4.3.Эндосомальные NHX - антипортеры растения 22
1.4.4.Вакуолярные NHX - антипортеры растений 22
1.4.4.1.Топология 23
1.4.4.2.Биохимические свойства 26
1.4.4.3.Регуляция активности 29
1.4.4.4.Вакуолярные NHX- антипортеры арабидопсиса 30
1.4.4.5. В акуолярные NHX- антипортеры ячменя HvNHX2 и HvNHX3 32
Глава 2. Материалы и методы 34
2.1. Растительный материал и условия выращивания 34
2.2.Питательные среды 34
2.3.Получение трансгенных растений арабидопсиса и картофеля 36
2.3.1.Векторные конструкции 36
2.3.2.Трансформация арабидопсиса методом "floral dip" 37
2.3.3.Агробактериальная трансформация картофеля 38
2.4.Методы работы с ДНК 39
2.4.1.Введение ДНК в Е.coli 39
2.4.2.Выделение плазмидной ДНК из клетокі?. coli 40
2.4.3.Выделение растительной ДНК для проведения ПЦР 40
2.4.4.Полимеразная цепная реакция 41
2.4.5. Горизонтальный электрофорез ДНК в агарозном геле 42
2.5.Методы работы с РНК 42
2.5.1.Выделение тотальной РНК 42
2.5.2.Проведение обратной транскрипции 43
2.5.3.Денатурирующий электрофорез РНК в агарозном геле 44
2.5.4.Проведение нозерн-гибридизации 45
2.6.Физиологические методы исследований 45
2.6.1.Постановка экспериментов 45
2.6.1.1.Оценка солеустойчивости трансгенных растений арабидопсиса 45
2.6.1.2.Анализ солеустойчивости трансгенных линий картофеля 46
2.6.2.Морфологическая характеристика растений 47
2.6.3. Опре деление содержания свободного пролина 48
2.6.4. Опре деление осмотического потенциала 48
2.6.5.Содержание№+иК+ 49
2.7. Статистический анализ 49
Глава 3. Результаты 51
3.1.Получение трансгенного арабидопсиса с экспрессией гена HvNHX2 или гена
HvNHX3 50
3.1.1.Трансформация арабидопсиса 50
3.1.2.Анализ экспрессии генов HvNHX2 или HvNHX3 52
3.2.Анализ солеустойчивости трансгенных растений арабидопсиса 54
3.2.1. Подбор концентрации NaCl для экспериментов 54
3.2.2.Влияние№С1 на ранней стадии развития растений 55
3.2.2.1 .Всхожесть
3.2.2.2.Рост корня проростков 57
3.2.3.Влияние NaCl на ростовые процессы растений 58
3.2.4.Содержание№иК+ 64
3.3.Получение трансгенного картофеля с экспрессией HvNHX2 или HvNHX3 69
З.З.І.Агробактериальная трансформация картофеля 69
3.3.2.Анализ экспрессии генов HvNHX2 или HvNHX3 70
ЗААнализ солеустойчивости трансгенных растений картофеля 72
3.4.1. Сравнение солеустойчивости трансгенного картофеля с экспрессией HvNHX2 и картофеля с экспрессией HvNHX3 72
3.4.2.Оценка солеустойчивости картофеля, экспрессирующего ген HvNHX2, при предварительном укоренении черенков 77
3.4.2.1.Морфометрические особенности и накопление биомассы 77
3.4.2.2. Осмотический потенциал клеточного сока при засолении 82
3.4.2.3.Влияние засоления на содержание Na и К в органах трансгенного картофеля экспрессирующего HvNHX2 83
3.4.3.Влияние NaCl на клубнеобразование и содержание Na и К в клубнях кар тофеля, экспрессирующего HvNHX2 86
Глава 4. Обсуждение результатов 89
Заключение 97
Выводы 99
Список сокращений и условных обозначений 101
Список литературы
