Введение
2. Обзор литературы 11
2.1 Состояние проблемы. 11
2.2 Определение взаимосвязи между последовательностями ДНК и их функциями 13
2.2.1 Инсерционный мутагенез. 14
2.2.1.1 Индукция инсерционных мутаций при помощи транспозонов 14
2.2.1.2 Индукция инсерционных мутаций при помощи Т-ДНК 15
2.2.1.3 Векторы для трансформации растений 19
2.2.1.4 Энхансеры. 22
2.2.1.5 Векторы специального назначения на основе фаговых систем рекомбинации. 25
27
2.3 Использование Arabidopsis thaliana в качестве модельного объекта молекулярно-генетических исследований высших растений.
2.3.1 Общие характеристики 27
2.3.2 Коллекции инсерционных мутантов A.thaliana 28
2.3.2.1 Коллекции loss-of-fimction мутантов 28
2.3.2.2 Коллекции gain-of-function мутантов 31
2.3.3 Морфологические мутанты. 33
2.4 Методы агробактериальной трансформации растений 34
2.5 Идентификация генов, меченных с помощью Т-ДНК 36
37
2.5.1 Амплификация методом ПЦР последовательностей ДНК, нуклеотидный состав которых неизвестен.
3.5.1 Метод инвертированного ПЦР (inverse PCR). 38
3.5.2 Метод «ТА1Ь»-ПЦР с адаптерами. 40
3.5.3 Метод «ТА1Ь»-ПЦР с вырожденными праймерами. 42
2.6 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК. 45
2.6.1 Интернет базы данных. 45
2.7 Итоги 47
Экспериментальная часть 48
3.Материалы и методы 48
3.1 Растительный материал i 48
3.2 Штаммы бактерий и плазмиды, использованные в работе 48
3.2.1 Бактериальные штаммы 48
3.2.2 Плазмиды 49 3.3. Среды, использованные в работе. 50 3.3.1 Среды для культивирования бактерий. 50 3.3.2. Среды для выращивания растений A. thaliana. 51
3.3.2.1 Среда для выращиваниг растений A.thaliana in vitro 51
3.3.2.2 Среда для скрининга инсеционных мутантов A.thaliana in vitro 51
3.3.2.3 Среда для выращивания растений A.thaliana in vitro в присутствии A. tumefaciens 51
3.3.3 Антибиотики, использованные в работе. 52
3.4 Приготовление компетентных клеток E.coli 52
3.4.1 Приготовление клеток E.coli с низкой компетентностью. 52
3.4.2 Приготовление клеток E.coli со средней компетентностью. 53
3.4.3 Приготовление клеток Е.соИ с высокой компетентностыо для электропорации. 53
3.5 Трансформация штаммов E.coli 54
3.5.1 Быстрая трансформация клеток с низкой компетентностыо. 54
3.5.2 Трансформация клеток со средней компетентностью. 55
3.5.3 Трансформация клеток с высокой компетентностью (электропорация). 55
3.5.4 Отбор рекомбинантных плазмид. 55
3.6 Метод быстрого клонирования. 56
3.7 ПЦР-скрининг бактериальных колоний. 57
3.8 Трансформация A. tumefaciens. 57
3.8.1 Конъюгативный перенос. 57
3.8.2 Прямой перенос. 58
3.8.3 Трансформация при помощи электропорации. 58
3.9 Поверхностная стерилизация семян A. thaliana. 59
3.9.1 Быстрая стерилизация 59
3.9.2 Долгая стерилизация 59
3.10 Выращивание растений A. thaliana 59
3.10.1 Выращивание растений A. thaliana в стерильных условиях. 59
3.10.2 Выращивание растений A. thaliana в открытом грунте. 60
3.10.3 Выращивание трансгенных линий A. thaliana в стрессовых условиях. 60
3.11 Агробактериальная трансформация A. thaliana 61
3.11.1 Трансформация прорастающих семян. 61
3.11.2 Трансформация неопыленных бутонов взрослых растений. 61
3.12 Отбор трансгенных растений A. thaliana. 62
3.12.1 Отбор трансгенных растений A. thaliana in vitro. 62
3.12.2 Отбор трансгенных растений A. thaliana с помощью гербицида Баста. 63
3.12.2.1 Отбор трансгенных растений A. thaliana в почве. 63
3.12.2.2 Отбор трансгенных растений A. thaliana на песке. 63
3.13 Выделение геномной ДНК из тканей A. thaliana. 64
64
3.13.1 Выделение геномной ДНК из тканей A. thaliana для ПЦР-тестирования. 64
3.13.2 Мини-препаративное выделение геномной ДНК из тканей A. thaliana 64
3.13.3 Выделение ДНК без примесей из тканей A.thaliana для клонирования и блот-гибридизации.
3.13.4 Выделение ДНК без примесей из тканей A.thaliana для получения FST. 65
3.14 Выделение плазмидной ДНК из клеток бактерий. 66
3.14.1 Мини-препаративное выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток. 66
66
3.14.2 Препаративное выделение плазмидной ДНК из штаммов E.coli тепловым
методом.
3.14.3 Выделение плазмидной ДНК с минимальным количеством примесей. 67
3.15 Очистка ДНК от примесей белков. 68
3.16 Очистка ДНК от примесей РНК. 68
3.17 Уменьшение объема пробы изо-бутанолом 69
3.18 Хроматографическая очистка ДНК 69
3.19 Очистка ДНК от агарозы. 70
3.19.1 Очистка ДНК при помощи трубчатого электрофореза. 70
3.19.2 Очистка ДНК при помощи электроэлюирования. 71
3.19.3 Очистка ДНК при помощи центрифугирования. 72
3.20 Стадии клонирования: рестикция, модификация и лигирование фрагментов ДНК.
3.20.1. Клонирование ПЦР-фрагментов 72
3.20.2. Приготовление Т-вектора. 73
3.21 Блот-гибридизация по Саузерну. 73
3.21.1 Рестрикция геномной ДНК. 73
3.21.2 Электрофорез и перенос на мембрану переваренной геномной ДНК. 74
3.21.3 Приготовление меченного зонда. 74
3.21.4 Гибридизация и радиоавтографирование. 74
76
3.22 Тестирование ДНК растений при помощи ПЦР. 74
3.23 ПЦР-амплификация области геномной ДНК A. thaliana, примыкающей к Т-ДНК инсерции. 3.23.1 Модифицированный метод ПЦР для локализаций инсерции. 77
3.24 Выделение РНК из растений 78
3.25 Синтез кДІ IK (обратная транскрипция). 78
3.25.1 Реакция обратной транскрипции. 78
3.25.2 Получение EST гена At3gJ8780 (геп «домашнего хозяйства», актин) 78
3.25.3 Получение EST гена At5gl0080. 79
3.25.4 Получение EST гена Atlg33390. 79
3.25.5 Получение EST гена At5g 13760. 79
3.25.6 Поучение полноразмерной кДНК гена At J g33390 79
3.26 Секвенирование ДІ IK. 80
3.26.1 Секвенирование в лаборатории 80
3.26.1.1. Подготовка стёкол 8 Г
3.26.1.2. Приготовление геля. 81
3.26.1.3. Заливка 81
3.26.1.4. Форез 81
3.26.1.5. Послефорезная обработка 81 3.26.1.6.Автограф 82
3.26.2 Автоматическое секвенирование 82
3.27 Активизация гена Сге в трансгенных линиях A.thaliana 82
3.27.1 Обработка дексометазоном в стерильных условиях. 82
3.27.2 Обработка дексометазоном в открытом грунте. 82
3.28 Тестирование растений на наличие эмбриональных леталей 82
4. Результаты и обсуждение. 83
4.0. Постановка задачи 83
86
4.1 Создание системы векторов для индукции супер-экспрессии генов у двудольных растений.
4.1.1. Создание вектора pEnLox для получения индуцирующих инсерционных мутаций . 86
4.1.1.1. Проверка вектора pEnLox 90
4.1.1.2. Свойства вектора pEnLox 91
93
4.1.2. Создание вспомогательного вектора рСге для реверсий мутаций супер-экспрессии генов, вызванных действием энхансера.
4.1.2.1. Проверка вектора рСге 94
4.1.2.2. Свойства вектора рСге 94
4.1.3. Система векторов pEnLox/pCre. 97
4.2 Расширение коллекции инсерционных мутантов Arabidopsis thaliana. 98
4.2.1. Трансформация растений Arabidopsis thaliana. 98
4.3 Анализ инсерционных мутантов Arabidopsis thaliana. 100
4.3.1. Отбор трансгенных растений. 100
4.3.2. Установление наличия и количества инсерций. 101
4.3.2.1. Анализ расщеплений в ТЗ поколении 101
4.3.2.2. Проверка при помощи блот-гибридизации по Саузерну 102
4.3.2.3. Проверка наличия энхансера Т-ДНК, интегрированной в геном методом ПЦР 103
4.3.3. Установление точной локализации инсерций в геноме. 104
4.3.3.1. Модифицированный метод RC-PCR (miPCR) 104
4.3.3.2. Амплификация примыкающей к бордеру последовательности не известной
геномной ДІIK
4.3.3.3. Определение нуклеотидной последовательности ПЦР фрагментов 111
4.3.3.4. Компьютерный анализ полученных данных. 111
4.4. Проверка работоспособности системы векторов pEnLox/pCre. 113
4.4.1. Скрещивание Е-линий с С-линиями. 113
4.4.2. Отбор мутантов по двум селективным маркерам. 114
4.4.3. Удаление энхансера из состава интегрированной в геном Т-ДНК. 115
4.4.4. Проверка эффективности удаления методом ПЦР 115 4.5 Морфологические мутанты Arabidopsis thaliana 116
4.5.1. Поиск мутантов с измененной морфологией. 116
17
4.5.2. Идентификация генов, супер-экспрессия которых влияет на морфогенез Arabidopsis thaliana.
4.5.2.1 Линия Е9 , 118
4.5.2.2. Компьютерный анализ гена At5gl0080 118
4.5.2.3 Линия Е78 120
4.5.2.4. Компьютерный анализ гена Atlg33390. 120
4.5.2.5. Линия El34 122
4.5.2.6. Компьютерный анализ гена At5gl3760. 122
4.5.2.7. Поиск возможных гомологов исследуемых генов A.thaliana. 124
4.5.2.8. Поиск информации об экспрессии исследуемых генов. 125
4.5.2.9. Проверка уровня экспрессии близлежащих к инсерциям генов. 128
4.5.3. Реверсия Е-мутантов к фенотипу дикого типа. 129
4.5.4. Обсуждение проблемы дистального действия энхансеров 132
5. Заключение 134
6. Выводы 135
7. Публикации 136
8. Тезисы конференций, устные и стендовые доклады 137
9. Зарегистрированные данные 140
10. Список литературы
