Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Вирус гепатита В (НВ V). Общая характеристика 9
1.1.1. Краткая история обнаружения и исследования вируса гепатита В, его таксономическое положение 9
1.1.2. Структура вируса гепатита В 10
1.1.2.1. Белки оболочки вируса гепатита В. 11
1.1.2.2. Главный белок оболочки вируса гепатита В (малый поверхностный антиген HBsAg) 11
1.1.3. Организация генома вируса гепатита В 15
1.1.4. Особенности репродукции вируса гепатита В 18
1.1.5. Регуляция синтеза поверхностных белков НВ V 21
1.1.6. Эпидемиология вируса гепатита В 22
1.2. Трансгенные растения - возможные системы для производства вакцин 24
1.2.1. Предпосылки для использования трансгенных
растений в качестве продуцентов вакцин 24
1.2.2. "Съедобные" ващины и их получение в растениях 27
1.2.2.1. Использование химерных вирусных конструкций
в создании вакцино-продуцирующих растений 30
1.2.2.2. Получение растений-продуцентов вакцин с использованием агробактериальной трансформации 32
1.2.2.3. Экспрессия в трансгенных растениях поверхностного антигена вируса гепатита В 36
1.2.3. Повышение уровня экспрессии трансгенов - одна из
задач генноинженерной биотехнологии растений 40
1.2.4. Увеличение синтеза HBsAg в трансгенных растениях -
одно из требований для разработки "съедобных" вакцин
против гепатита В 41
2. Материалы и методы 45
2.1. Бактериальные штаммы и ллазмиды 45
2.2. Растения 46
2.3. Среды 46
2.3.1. Микробиологические среды 46
2.3.2. Среды для культивирования растений 46
2.4. Растворы 47
2.4.1. Другие растворы и буферы 48
2.5 Ферменты 49
2.6. Другие реактивы и материалы 49
2.7. Выделение, очистка и машшуляции с плазмидной ДНК 49
2.8. Конструирование плазмид для трансформации растений 50
2.9. Введение метки в ДНК 51
2.10. Скрининг рекомбинантных клонов 51
2.11. Перенос ДНК на фильтры по Саузерну 52
2.12. Гибридизация на фильтрах по Саузерну 53
2.13. Трансформация листовых дисков табака 53
2.14. Выделение суммарной растительной ДНК 54
2.15. Определение активности неомицинфосфотрансферазы 11 (NPTII) 54
2.16. Выделение тотальной растительной РНК с использованием горячего фенола 55
2.17. РНК-ДНК гибридизация 56
2.18. ПЦР-анализ трансгенных растений 57
2.19. Определение содержания HBs-антигена в трансгенных растениях 57
2.19.1 Подготовка пробы 58 2.19.2. Процедура 58
2.20. Фракционирование белков из экстракта растений сульфатом аммония разных степеней насыщения (5-80%) 60
2.21. Иммуноблоттинг 60
3. Результаты и их обсуждение 62
3.1. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) 64
3.1.1. Конструирование плазмид для трансформации растений, содержащих ген HBsAg под контролем одинарного и двойного промоторов 35S РНК вируса мозаики цветной капусты 64
3.1.2. Генетическая трансформация растений табака 76
3.1.3 Молекулярно-биохимический анализ растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В 78
3.2. Анализ HBs-антигена в трансгенных растениях табака 84
3.3. Анализ поколения F1 трансгенных растений табака, содержащих ген HBsAg под контролем двойного промотора 35S 89
Заключение 93
Выводы 96
Список литературы 97
