Введение
Глава 1. Источники целлюлозосодержащего сырья и его состав 8
Глава 2. Состав, строение и основные свойства компонентов растительной клеточной стенки 12
2.2. Целлюлоза 13
2.2. Гемицеллюлозы 14
2.3. Пектины и лигнин 16
Глава 3. Ферментативная деградация целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ) 18
3.1. Общие сведения о гликозил-гидролазах, участвующих в гидролизе ЦСМ 18
3.2. Целлюлазы 19
3.3. Гемице ллю лазы 24
3.4. Механизм действия целлюлазного комплекса 32
3.5. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы 35
Глава 4. Штамм Penicillium verruculosum и компоненты секретируемого им ферментного комплекса 39
Экспериментальная часть 43
Глава 5. Объекты исследования и методы экспериментов 43
5.1. Ферментные препараты 43
5.2. Субстраты 43
5.3. Прочие реактивы 43
5.4. Хроматографические сорбенты 44
5.5. Проведение полимеразной цепной реакции и получение генетических конструкций 44
5.6. Окрашивание агаризованной среды с аморфной целлюлозой конго красным 45
5.7. Культивирование трансформантов P. verruculosum в 3-л ферментерах 45
5.8. Метод определения концентрации белка 46
5.9. Методы определение биохимических характеристик ферментов 47
5.10. Методы определения активности ферментов 47
5.11. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков 49
5.12. Определение температурного и рН-оптимума действия ферментных препаратов 50
5.13. Изучение термо- и рН-стабильности ферментных препаратов 50
5.14. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов
гидролиза целлюлозосодержащего сырья 50
5.15. Хроматографическое фракционирование препаратов P. verruculosum 51
5.16. Гидролиз цсллюлозосодержащих материалов 52
Результаты и их обсуждение 53
Глава 6. Получение ферментных препаратов на основе рекомбинантньк штаммов Р. verruculosum 53
6.1. Выделение генов и создание экспрессионных конструкций 54
6.2. Трансформация штамма-реципиента P. verruculosum 537 57
6.3. Первичный скрининг полученных трансформантов 57
6.3.1. Первичный скрининг трансформантов, содержащих гетерологичные целлюлазы 57
6.3.2. Первичный скрининг трансформантов, содержащих гетерологичные гемицеллюлазы 64
6.4. Получение рскомбинантных ферментных препаратов 73
Глава 7. Физико-химические свойства новых ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов P. verruculosum 74
7.1. Анализ ферментных препаратов с помощью методов электрофореза и изоэлектрофокусирования 74
7.2. Активность ферментных препаратов по отношению к различным субстратам 77
7.3. рН- и температурные оптимумы активности ферментных препаратов, стабильность ферментных препаратов 73
Глава 8. Гидролиз полисахаридных субстратов лабораторными мультиферментными препаратами, полученными с помощью рекомбинантных штаммов P. verruculosum 88
8.1. Результаты гидролиза измельченной осиновой древесины 88
8.2. Результаты гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины 97 8.2. Результаты гидролиза измельченной багассы 105
8.4. Результаты гидролиза микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) 112
8.5. Сравнение эффективности гидролиза растительных субстратов ферментными
препаратами, полученными с помощью рекомбинантных штаммов P. verruculosum
и коммерческими ферментными препаратами 120
8.6. Влияние рН и температуры на эффективность гидролиза ЦСМ 124
Глава 9. Состав рекомбинантных ферментных препаратов 128
Выводы 131
Список литературы
