Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Стволовые клетки и их типы 12
1.1.1. Эмбриональные карциномные клетки. Тератомы, тератокарциномы 14
1.1.2. Эмбриональные стволовые клетки 15
1.1.2.1. Механизмы сохранения плюрипотентности и гены, участвующие в поддержании плюрипотентного статуса линий ЭС клеток 20
1.1.2.2. Маркеры, характерные для шнорипотентных клеток 26
1.1.3. Эмбриональные терминальные клетки 27
1.1.4. Трофобластные стволовые клетки 28
1.1.4.1. Постимплантационное развитие эмбрионов, дифференцировка трофобластных клеток in vivo и формирование плаценты 28
1.1.4.2. Получение и дифференцировка ТС клеток 30
1.1.4.3. Транскрипционные факторы и сигнальные пути, характерные для ТС клеток мыши и их производных 32
1.1.5. Стволовые клетки экстраэмбрионалыюй энтодермы 37
1.2. Инактивация Х-хромосомы в клетках самок млекопитающих 39
Глава 2. Материалы и методы 45
2.1. Экспериментальные животные 45
2.2. Растворы, буферы 45
2.3. Среды для получения и культивирования клеточных линий 46
2.3.1. Ростовая среда для получения и культивирования первичных эмбриональных фибробластов 46
2.3.2. Ростовая среда для культивировании ЭС клеток мыши 46
2.3.3. Ростовая среда для получения и культивирования СК полевки эмбрионального происхождения 46
2.3.4. Приготовление кондиционной среды для культивирования СК полевки без эмбриональных фибробластов 46
2.3.5. Ростовая среда для культивирования ТС клеток мыши 47
2.3.6. Среда для культивирования эмбриоидных тел 47
2.4. Получение культур клеток 48
2.4.1. Получение первичных эмбриональных фибробластов 48
2.4.2. Получение стволовых клеток полевки из предымплантационных бластоцист 48
2.4.3. Получение ЭГ клеток полевки из эмбрионов на стадии 7,5-8,5 д.п.о 49
2.5. Культивирование клеток 49
2.5.1. Культивирование первичных эмбриональных фибробластов 49
2.5.2. Культивирование и селекция СК полевки 50
2.5.3. Культивирование ЭС клеток мыши 51
2.5.4. Культивирование ТС клеток мыши 51
2.6. Замораживание клеток в жидком азоте 52
2.7. Размораживание клеток 52
2.8. Субклонирование 52
2.9 Тесты по оценке плюрипотентности линий полученных клеток 53
2.9.1. Гистохимическое выявление активности эндогенной щелочной фосфатазы 53
2.9.2. Спонтанная дифференцировка in vitro стволовых клеток полевок 53
2.9.3. Дифференцировка СК полевок in vivo 54
2.9.4. Иммуногистохимичсское выявление поверхностных клеточных антигенов ЕСМА7 и SSEA-1, транскрипционных факторов GATA4 и GATA6 54
2.10. Анализ кариотипа стволовых клеток 55
2.10.1. Фиксация клеток в суспензии 55
2.10.2. Фиксация культуры клеток в чашке Петри 56
2.10.3. Дифференциальное окрашивание хромосом (G-окрашивание) 56
2.10.4. Анализ плоидности линий СК полевок при помощи ДНК профилирования ядер клеток 56
2.11. Выделение РНК 57
2.11.1. Общие требования 57
2.11.2. Выделение РНК с помощью RNAzol В 57
2.11.3. Обработка РНК ДНКазойІ 58
2.12. Синтез кДНК методом обратной транскрипции 58
2.13. Полимеразная цепная реакция 59
2.14. Электрофорез ДНК в агарозном геле 60
2.15. Флуоресцентная in situ гибридизация 60
2.16. РНК-ДНК флуоресцентная in situ гибридизация 62
2.17. Выявление позднореплицирующегося хроматина 62
Глава 3. Результаты 64
3.1. Попытки получения СК полевки эмбрионального происхождения с использованием LIF мыши 64
3.2. Получение СК обыкновенной полевки эмбрионального происхождения с использованием LIF полевки 66
3.3. Фенотипическая характеристика полученных клеток полевки 67
3.4. Культивирование полученных клеток полевки 68
3.5. Дифференцировка полученных линий СК полевки 69
3.5.1. Спонтанная дифференцировка полученных клеток in vitro 69
3.5.2. Индуцированная дифференцировка полученных культур клеток 71
3.6. Анализ активности щелочной фосфатазы в полученных клетках 75
3.7. Кариотипирование полученных СК полевки 77
3.8. Молекулярно-генетическии анализ профиля экспрессии генов в полученных клетках полевки 79
3.9. Инактивация Х-хромосомы в полученных СК полевки 84
Заключение 97
Выводы 100
Список используемой литературы 101
