Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1 Характеристика IgA-протеаз 13
1.1.1 Открытие IgA-протеаз 13
1.1.2 Секреторный иммунитет. Структура сывороточного и секреторного IgA 15
1.1.3 Структура генов IgA-протеаз и экспрессия их продуктов в грамотрицательных бактериях 18
1.1.4 Методы обнаружения IgA-протеаз и определение активности 19
1.1.5 Очистка IgA 1 -протеаз и IgA 1 19
1.1.6 Гидролиз IgAl и специфичность IgA-протеаз 21
1.1.7 IgAl-протеазы как фактор вирулентности 23
1.2 Проблема вакцинации против менингита и менингококковая IgAl-протеаза 25
1.3 Факторы патогенности и вирулентности N.meningitidis 32
1.4 Питательные среды для культивирования менингококков 34
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36
2.1 Микроорганизмы, задействованные в работе и методики по работе с ними 36
2.1.1 Проверка биохимических, морфологических и серологических свойств N. meningitidis 37
2.1.2 Определение чувствительности штаммов N.meningitidis к антибактериальным препаратам 37
2.1.3 Подбор питательной среды для штаммов N. meningitidis 3 8
2.1.4 Подготовка посевного материала 40
2.1.5 Глубинное культивирование штаммов N. meningitidis 41
2.2 Определение ферментативной активности IgAl-
протеазы 42
2.2.1 Выделение иммунохимически чистых IgAl и IgA2 42
2.2.2 Иммунизация животных 43
2.2.3 Выделение IgG из кроличьей антисыворотки 44
2.2.4 Получение конъюгата антител к IgA с пероксидазой хрена 45
2.2.5 Определение разведения конъюгата 46
2.2.6 Качественный метод определения ферментативной активности IgAl-протеазы методом ИФА 48
2.2.7 Количественный метод определения ферментативной активности IgAl-протеазы 49
2.3 Выделение и очистка IgA-протеазы 51
2.3.1 Предварительная обработка культуральной жидкости и концентрирование 51
2.3.2 Очистка на высокопористом силохроме 51
2.3.3 Очистка на фенилсефарозе 52
2.3.4 Гель-фильтрация 52
2.4 Свойства IgAl-протеазы 53
2.4.1 Определение изоэлектрической точки IgAl-протеазы 53
2.4.2 Определение констант ингибирования IgAl-протеазы 5
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 54
3 Культивирование N. meningitidis 55
3.1 Проверка морфологических, биохимических и серологических свойств штаммов N. meningitidis 55
3.2 Определение чувствительности штаммов N. meningitidis к антибактериальным препаратам 57
3.3 Подбор плотной питательной среды для штаммов N. meningitidis 58
3.4 Подбор жидкой питательной среды для штаммов N. meningitidis 60
3.5 Выбор штамма N. meningitidis для культивирования 63
3.6 Подготовка посевного материала 65
3.7 Глубинное культивирование штаммов N. meningitidis 66
4 Определение ферментативной активности IgAl- 68
протеазы
4.1 Качественный метод определения ферментативной активности IgA 1 -протеазы 6 8
4.2 Количественный метод определения ферментативной активности IgAl-протеазы 72
5 Выделение и очистка IgAl-протеазы 75
5.1 Предварительная обработка культуральной жидкости 75
5.2 Очистка на высокопористом силохроме 76
5.3 Гидрофобная хроматография на фенилсефарозе 79
5.4 Гель-фильтрация на сефарозе CL-6B 81
5.5 Схема очистки и данные по выходу фермента 83
6 Свойства IgAl-протеазы 85
6.1 Определение молекулярной массы IgAl - протеазы 85
Определение изоэлектрической точки IgAl - протеазы 86
Определение констант ингибирования для IgAl - протеазы 87
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 88
ВЫВОДЫ 90
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 91
ЛИТЕРАТУРА 92
