Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Антитела к нативной ДНК как критерий диагностики аутоиммунных заболеваний 12
1.2. Наногравиметрические биосенсоры как инструмент биохимических исследований 16
1.2.1. Биосенсоры на основе пьезокварцевых резонаторов 18
1.2.2. Физические основы масс-чувствительности пьезокварцевых резонаторов 22
1.2.3. Конструирование пьезокварцевого биосенсора 26
1.2.4. Иммобилизация биологического компонента биосенсора 28
1.3. Методы формирования и изучения свойств ДНК-содержащих
рецепторних покрытий биосенсоров 31
1.3.1. Ковалентные методы иммобилизации нуклеиновых кислот 36
1.3.2. Нековалентные методы иммобилизации нуклеиновых кислот 45
1.3.3. Бионанотехнологические подходы к иммобилизации нуклеиновых кислот 49
1.3.4. Атомно-силовая микроскопия как инструмент для изучения биологических объектов 51
1.4. Заключение по обзору литературы 54
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 55
2.1. Оборудование и реактивы 55
2.2. Объекты исследований 57
2.3. Кварцевые микровесы - устройство и применение 58
2.3.1. Кварцевые микровесы для анализа в газовом режиме 58
2.3.2. Кварцевые микровесы QCM 200 59
2.4. Проточно-инжекцирный режим исследования 63
2.4.1. Дегазация растворов 63
2.4.2. Термостатирование 63
2.4.3. Установка проточной ячейки 63
2.4.4. Перистальтический нанос и система трубок 64
2.5. Предварительная обработка и очистка электродов ПКР 64
2.6. Нанесение биологических пленок на электрод ПКР 67
2.7. Определение слоя-предшественника для иммобилизации ДНК 67
2.8. Формирование поли-Ь-лизинового слоя-предшественника 68
2.8.1. Определение оптимального значения рН 68
2.8.2. Определение оптимального значения температуры 68
2.8.3. Определение оптимального времени инкубации 69
2.8.4. Определение оптимальной концентрации поли-Ь-лизина 69
2.8.5. Зависимость формирования поли-Ь-лизинового слоя-предшественника от материала и обработки поверхности электрода ПКР 69
2.9. Визуализация поверхности электродов кварцевых резонаторов методом атомно-силовой микроскопии 69
2.10. Формирование ДНК-содержащей пленки 70
2.10.1. Определение чистоты и однородности препарата нативной ДНК 70
2.10.2. Определение буферного раствора 71
2.10.3. Определение оптимальной концентрации ДНК 71
2.10.4. Определение оптимального значения температуры 71
2.11. Характеристика формирования и свойства ДНК-содержащей пленки 71
2.11.1. Изучение взаимодействия иммобилизиованного поли-Ь-лизина и ДНК in situ 72
2.11.2. Кинетика связывания поли-Ь-лизина и ДНК 73
2.11.3. Определение вязкостно-эластичных свойств ДНК- содержащей нанопленки 73
2.12. Визуализация поверхности ДНК-содержащей нанопленки методом атомно-силовой микроскопии 73
2.12.1. Предварительная обработка золотых подложек 74
2.12.2. Приготовление проб для исследования 74
2.12.3. Визуализация наноструктурированных поверхностей с помощью АСМ 75
2.12.4. Обработка АСМ-изображений 76
2.13. Применение ДНК-содержащей нанопленки в качестве чувствительного слоя пьезокварцевого биосенсора 76
2.13.1. Блокировка сайтов неспецифического связывания 76
2.13.2. Иммуноанализ 77
2.14. Оценка результатов и статистическая обработка 77
2.14.1. Пьезокварцевая масс-чувствительность в газовой среде 77
2.14.2. Пьезокварцевая масс-чувствительность в жидкой среде 78
2.14.3. Статистическая обработка результатов 80
ГЛАВА 3. Результаты исследований 81
3.1. Определение и формирование слоя-предшественника для иммобилизации нативной ДНК 81
3.1.1. Слой-предшественник для иммобилизации ДНК 82
3.1.2. Формирование поли-Ь-лизинового слоя-предшественника на серебряных электродах в газовом режиме 84
3.1.3. Определение характера формирования поли-Ь-лизинового слоя в зависимости от материала и обработки электродов ПКР 89
3.1.4. Формирование поли-Ь-лизинового слоя-предшественника на золотых электродах в газовом режиме 92
3.1.5. Регенерация электродов ПКР для последующего их использования 93
3.2. Формирование и характеристика ДНК-содержащей пленки 95
3.2.1. Определение чистоты и однородности нативной ДНК 95
3.2.2. Определение буферного раствора для иммобилизации ДНК 96
3.2.3. Определение оптимальной концентрации ДНК 97
3.2.4. Определение оптимальной температуры присоединения ДНК 98
3.2.5. Изучение взаимодействия иммобилизованного поли-L-лизина и ДНК in situ в проточно-инжекционном режиме 99
3.2.6. Влияние молекулярной массы поли-Ь-лизина на связывание нативной ДНК 103
3.2.7. Кинетика связывания нативной ДНК с иммобилизованным поли-Ь-лизином 105
3.2.8. Изучение структуры ДНК-содержащей пленки методом атомно-силовой микроскопии 106
3.3. Иммуноанализ при помощи ДНК-биосенсора на основе ДНК-содержащей нанопленки 109
3.3.1 Иммуноанализ в газовом режиме 109
3.3.2. Иммуноанализ в жидкостном режиме 112
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 121
Выводы 136
Литература 137
