Введение
II. Литературный обзор 8
2.1. Локализация, основные свойства, структура и механизм действия NAD+- зависимых формиатдегидрогеназ 8
2.1.1. Локализация ФДГ 8
2.1.2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей ФДГ .. 15
2.1.3. Молекулярный механизм ФДГ 20
2.1.4. Трехмерная структура МАЕ)+-зависимой формиатдегидрогеназы из Pseudomonas sp.101 24
2.1.5. Экспрессия ФДГ в клетках E.coli 31
2.1.6. Кинетические параметры и взаимодействие активных центров ФДГ.. 33
2.1.7. Субстратная специфичность ФДГ 35
2.1.8. Коферментная специфичность ФДГ 36
2.2. Термостабильность формиатдегидрогеназ из различных источников 38
2.2.1. Механизмы инактивации ФДГ 38
2.2.2. Сравнение термостабильности ФДГ из различных источников 39
2.2.3 Увеличение термостабильности ФДГ из Pseudomonas sp.101 42
2.3. Дифференциальная сканирующая калориметрия как метод изучения структуры белков 43
2.3.1. Техника сканирующей калориметрии 43
2.3.2. Калориметрические измерения 45
2.3.3. Анализ результатов ДСК 48
III. Экспериментальная часть 51
3.1. Материалы 51
3.2. Методы исследований 52
3.2.1. Трансформация клеток .coli 52
3.2.2. Выделение плазмидной ДНК 52
3.2.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле 53
3.2.4. Наработка биомассы 53
3.2.5. Выделение формиатдегидрогеназы 54
3.2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле 55
3.2.7. Определение концентрации ФДГ 55
3.2.8. Измерение активности ФДГ 55
3.2.9. Исследование термоинактивации ФДГ 55
3.2.10. Анализ кинетических данных и расчет кинтеических констант 56
3.2.11. Анализ трехмерных структур ФДГ 56
3.2.12. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) 56
3.2.13. Анализ кривых плавления 57
3.2.14. Круговой дихроизм (КД) 58
IV. Результаты и их обсуждение 59
4.1. Экспрессия формиатдегидрогеназ в клетках Е.coli 59
4.1.1. Экспрессия формиатдегидрогеназ из Arabidopsis thaliana и Glycine max в клетках E.coli 59
4.1.2. Экспрессия формиатдегидрогеназ из Pseudomonas sp.101, Candida boidinii, Moraxella sp.C-1, Saccharomyces cerevisiae в клетках E.coli 62
4.2. Изучение кинетических свойств рекомбинантных растительных формиатдегидрогеназ 63
4.3. Изучение кинетики термоинактивации рекомбинантных растительных формиатдегидрогеназ 68
4.4. Изучение термостабильности формиатдегидрогеназ из различных источников с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии... 76
4.5. Изучение термостабильности формиатдегидрогеназ из различных источников с помощью спектров кругового дихроизма 94
4.6. Исследование структуры формиатдегидрогеназ из различных источников с помощью рентгеноструктурного анализа 100
V. Выводы 105
Vi. Список литературы 106
Благодарности 121
